目的:本研究通過建立過表達(dá)IL-10的EPCs,明確IL-10對(duì)EPCs生物學(xué)特征的影響;研究IL-10修飾的EPCs對(duì)非增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變病情的影響,并探討其作用途徑。方法:(1)采用密度梯度離心法提取出生后7天~9天的雄性Wistar大鼠骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,將其接種培養(yǎng)于預(yù)先使用纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板中;培養(yǎng)7天后,利用Dil標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(Dil-ac LDL)和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素(FITC-UEA-I)雙標(biāo)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法,以及FITC標(biāo)記的血管性血友病因子(FITC-v WF)、PE標(biāo)記的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(PE-VEGFR2)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定EPCs。并將慢病毒包裝的IL-10質(zhì)粒(EPC-LV-IL-10-GFP)或空白質(zhì)粒感染EPCs(EPC-LV-NC-GFP),感染48~72小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察感染效率,并采用流式細(xì)胞儀、Transwell法、成管能力和粘附能力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞周期、遷移、成管和粘附功能。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)量各組細(xì)胞培養(yǎng)基中多種炎性因子的表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)測(cè)定各組細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號(hào)通路中相關(guān)因子表達(dá)的變化。(2)雄性成年Wistar大鼠240只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(40只)和實(shí)驗(yàn)組(200只)。實(shí)驗(yàn)組采用腹腔一次性注射鏈脲佐菌素建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型,造模成功后3個(gè)月時(shí),實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(40只)、實(shí)驗(yàn)治療組(EPC-IL-10-GFP)(80只),實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(EPC-NC-GFP)(80只)。同時(shí)按照第(1)部分的方法制備EPC-LV-IL-10-GFP和EPC-LV-NC-GFP。正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組不給予任何干預(yù);實(shí)驗(yàn)治療組給予EPC-LV-IL-10-GFP(1×105/100μL)鼠尾靜脈注射;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組給予等量EPC-LV-NC-GFP鼠尾靜脈注射。干預(yù)后2周時(shí)處死大鼠摘除眼球,行免疫組織化學(xué)法分析大鼠視網(wǎng)膜中綠色熒光蛋白的表達(dá),并行視網(wǎng)膜熒光染色鋪片檢查大鼠視網(wǎng)膜血管的滲漏情況。并于干預(yù)后1周、2周及4周時(shí)應(yīng)用伊文思藍(lán)(evans blue,EB)定量檢測(cè)血視網(wǎng)膜屏障的破壞程度,并處死大鼠摘除眼球行HE染色和枸櫞酸鉛染色,熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜病理組織學(xué)改變。(3)雄性成年Wistar大鼠48只,按照第(2)部分的分組和方法制備動(dòng)物模型并給予同樣的干預(yù)。在干預(yù)后2周處死大鼠摘除眼球,采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western Blot測(cè)定視網(wǎng)膜中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、金屬蛋白酶9(matrix metallproteinases-9,MMP-9)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(interleukin 6)、IL-10、核因子κB(nuclear factorkappa B,NF-κB)、核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IκB)及核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)m RNA水平及蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)正常細(xì)胞組中,EPC組、EPC-LV-IL-10-GFP組和EPC-LV-NC-GFP組間細(xì)胞粘附、遷移和成管能力無顯著性差異(F=1.414,1.817,0.025,P=0.25,0.169,0.976),各組細(xì)胞分布于G1期、S期、和G2期的比例基本相同;培養(yǎng)基中加入重組大鼠TNF-α誘導(dǎo)后,EPC組、EPC-LV-IL-10-GFP組和EPC-LV-NC-GFP組間細(xì)胞粘附、遷移和成管能力有顯著性差異(F=8.260,135.903,13.246,P=0.001,0,0.011)。EPC-LV-IL-10-GFP組細(xì)胞粘附、遷移及成管能力較其他兩組顯著增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001,0.001;0,0;0.013,0.009)。(2)ELISA檢測(cè):正常細(xì)胞組中,EPC組、EPC-LV-IL-10-GFP組和EPC-LV-NC-GFP組間培養(yǎng)基中TNF-α、IL-10、IL-8和VEGF濃度比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.910,14.242,10.795,26.097,P=0,0,0.002,0);EPC-LV-IL-10-GFP組與EPC組、和EPC-LV-NC-GFP組相比,TNF-α和IL-8的濃度明顯下降(P=0,0;0.002,0.001);IL-10和VEGF的濃度明顯升高(P=0.012,0.025;0,0),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)基中加入重組大鼠TNF-α誘導(dǎo)后TNF-α、IL-10、IL-8和VEGF濃度檢測(cè)結(jié)果與以上結(jié)果相似,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.734,5.16,10.067,28.157,P=0,0.024,0.003,0);EPC-LV-IL-10-GFP組與EPC組、和EPC-LV-NC-GFP組相比,TNF-α和IL-8的濃度明顯下降(P=0,0;0.002,0.002);IL-10和VEGF的濃度明顯升高(P=0.012,0.025;0,0),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)與EPC組和EPC-LV-NC-GFP組相比,EPC-LV-IL-10-GFP組中細(xì)胞VEGF、MMP-9和p-STAT3的蛋白表達(dá)明顯增加,而STAT3的蛋白表達(dá)下降。(4)給藥后2周,GFP在正常對(duì)照組及糖尿病對(duì)照組視網(wǎng)膜組織中呈陰性表達(dá);在EPC-NC-GFP組和EPC-IL-10-GFP組均呈陽性表達(dá)。HE染色結(jié)果表明:糖尿病對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層組織變薄,內(nèi)界膜水腫,表面欠光滑,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)量有所降低且神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列不整齊,神經(jīng)上皮層內(nèi)偶爾可見異常的毛細(xì)血管;給藥后實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)治療組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)界膜水腫減輕,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列較糖尿病對(duì)照組整齊,尤其在給藥后2周效果顯著,并可維持至給藥后4周。視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)顯示:糖尿病對(duì)照組視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜明顯增厚,管腔變窄幾乎阻塞,內(nèi)膜有斷裂,Bruch膜增寬,血管基底膜失去窗孔樣結(jié)構(gòu)。給藥后實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)治療組視網(wǎng)膜內(nèi)管腔閉塞的小血管數(shù)量減少,管腔通暢的血管數(shù)量增多,在同一根血管內(nèi)即可見到退行性改變的內(nèi)皮細(xì)胞又可見到健康的內(nèi)皮細(xì)胞,尤其在實(shí)驗(yàn)治療組中可見視網(wǎng)膜小血管充盈程度提高,部分小血管通暢,一些小血管似有新生。(5)干預(yù)后2周,EB血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示:正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)清晰,未見熒光滲漏;DM組大鼠視網(wǎng)膜血管彌漫性滲漏呈高熒光改變,局部血管迂曲、節(jié)段性擴(kuò)張;EPC-NC-GFP組大鼠視網(wǎng)膜血管彌漫性滲漏也明顯減輕,但血管局部高熒光滲漏多于治療組;EPC-IL-10-GFP組大鼠視網(wǎng)膜血管彌漫性滲漏明顯減輕,血管迂曲擴(kuò)張不明顯,僅見血管局部呈高熒光滲漏。治療后1周,2周和4周組間EB平均滲漏量比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.316,95.734,101.608,P=0,0,0)。治療后不同時(shí)間點(diǎn)組間比較,糖尿病對(duì)照組EB平均滲漏量較正常對(duì)照組明顯增加(P=0,0,0),EPC-IL-10-GFP組、EPC-NC-GFP組EB平均滲漏量較糖尿病對(duì)照組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0,0,0;0,0,0)。治療后1周EPC-IL-10-GFP組和EPC-NC-GFP組EB平均滲漏量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.833);治療后2周和4周EPC-IL-10-GFP組EB平均滲漏量較EPC-NC-GFP組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033,0.043)。(6)Western Blot結(jié)果顯示:TNF-α、IL-6、IKK-β、P65、i NOS和VEGF在糖尿病對(duì)照組中蛋白表達(dá)升高,在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)治療組中表達(dá)均降低,尤其在實(shí)驗(yàn)治療組中表達(dá)最低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-10、IκB-α和e NOS的蛋白表達(dá)與之相反,在糖尿病對(duì)照組中表達(dá)降低,在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)治療組中表達(dá)升高,尤其在實(shí)驗(yàn)治療組中表達(dá)最高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-9和Ang-1在糖尿病對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)治療組中蛋白表達(dá)均升高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR結(jié)果顯示VEGF、Ang-1、MMP-9、i NOS和e NOS m RNA水平變化與蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致。結(jié)論:(1)過表達(dá)的IL-10對(duì)EPCs生物學(xué)特性無明顯影響,且過表達(dá)的IL-10可以通過激活STAT3信號(hào)通路,改善TNF-α誘導(dǎo)下的細(xì)胞生物學(xué)功能。(2)IL-10修飾的EPCs可以成功轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜組織,可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路改善視網(wǎng)膜局部炎性微環(huán)境并增強(qiáng)EPCs功能,延緩了非增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R774.1;R587.2
【部分圖文】：

液去除未貼壁的細(xì)胞或者死細(xì)胞后，已貼壁的細(xì)胞快速增殖，培養(yǎng)至 6-7 天時(shí)，顯微鏡下可見梭型細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)。(圖 1.6B)。圖1.6 顯微鏡下觀察EPCs。A示為細(xì)胞呈短梭型或多角形（×200）；B示典型的細(xì)胞集落形成（×100）1.2.1.2 細(xì)胞表面標(biāo)志物 FITC-vWF 的鑒定培養(yǎng)第 7 天的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光化學(xué)染色法染色后，在熒光倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核結(jié)合 DAPI 后呈藍(lán)色熒光（圖 1.7A），細(xì)胞表面抗原結(jié)合 FITC-vWF后呈綠色熒光（圖 1.7B），染色的細(xì)胞均為分化的 EPCs（圖 1.7C）。圖 1.7 培養(yǎng)第 7 天時(shí) EPCs 結(jié)合 FITC-vWF 表型鑒定（×100）。A 示為細(xì)胞核結(jié)合 DAPI 后呈藍(lán)色；B 示結(jié)合 FITC-vWF 后呈綠色熒光；C 示雙染結(jié)合的 EPCs

顯微鏡下可見梭型細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)。(圖 1.6B)。圖1.6 顯微鏡下觀察EPCs。A示為細(xì)胞呈短梭型或多角形（×200）；B示典型的細(xì)胞集落形成（×100）1.2.1.2 細(xì)胞表面標(biāo)志物 FITC-vWF 的鑒定培養(yǎng)第 7 天的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光化學(xué)染色法染色后，在熒光倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核結(jié)合 DAPI 后呈藍(lán)色熒光（圖 1.7A），細(xì)胞表面抗原結(jié)合 FITC-vWF后呈綠色熒光（圖 1.7B），染色的細(xì)胞均為分化的 EPCs（圖 1.7C）。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、過表達(dá)的 IL-10 對(duì)大鼠骨髓起源的 EPCs 生物學(xué)特性的影響1.2.1.3 細(xì)胞表面標(biāo)志物 PE-VEGFR2 的鑒定培養(yǎng)第 7 天的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光化學(xué)染色法染色后，在熒光倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核結(jié)合 DAPI 后呈藍(lán)色熒光（圖 1.8A），細(xì)胞表面抗原結(jié)合 PE-VEGFR2后呈紅色熒光（圖 1.8 B），染色的細(xì)胞均為分化的 EPCs（圖 1.8C）。
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2880397