2017年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,目前全球有4.25億人罹患糖尿病,糖尿病已成為21世紀全球最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一,嚴重影響人類的生命健康。而糖尿病周圍神經(jīng)病變作為最常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一,可以引起反復(fù)下肢感染、潰瘍、非創(chuàng)傷性截肢等,花費巨大,致殘率高,嚴重降低患者的生活質(zhì)量。經(jīng)典的Wnt信號通路在代謝性疾病的發(fā)生中也發(fā)揮著廣泛的作用。參與調(diào)控脂肪細胞分化,胰腺器官發(fā)育,胰島β細胞分化,胰島素的合成和分泌等,對糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的出現(xiàn)起著重要的作用。近年來研究表明,經(jīng)典的Wnt信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān),在神經(jīng)管的形成、背根神經(jīng)節(jié)及中腦的發(fā)育中有重要作用。但經(jīng)典的Wnt信號通路與糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)系并不清楚,因此深入研究經(jīng)典Wnt信號通路與DPN發(fā)生的關(guān)系并揭示作用機制,對于防治糖尿病周圍神經(jīng)病變具有重要的臨床意義。第一部分確定經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵基因在DPN患者中表達情況的變化目的以正常人群、無DPN的糖尿病患者及并發(fā)DPN的糖尿病患者空腹外周血液作為研究對象,探究經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在這三組人群中表達的差異,并分析其表達水平與糖尿病臨床指標之間的相關(guān)性。方法1.自2017年12月-2018年5月,按照糖尿病臨床診斷標準和DPN診斷標準,收集正常人群、無DPN的糖尿病患者及并發(fā)DPN的糖尿病患者的空腹外周血液,外周血EDTAK2抗凝處理后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆�。同時收集三組人群的臨床生化檢測數(shù)據(jù)及T2DM患者的病歷資料。2.提取血液總RNA并測定其純度和含量,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到RNA的c DNA。3.利用Real-Time PCR技術(shù)及經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin,c-myc,cyclin D1,DKK1的正向和反向引物進行擴增,擴增內(nèi)參基因β-actin作為對照,分析經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在三組人群中的表達差異。4.分析經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子表達水平與Hb A1c之間的相關(guān)性。結(jié)果1.經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在三組人群中的表達差異:Real-Time PCR結(jié)果顯示,β-catenin,c-myc,cyclin D1在T2DM及DPN患者中表達降低(P0.05),而DKK1在T2DM及DPN患者中表達升高(P0.05),且在DPN患者中更甚。2.β-catenin,c-myc,cyclin D1分子水平與T2DM人群的Hb A1c呈負相關(guān),DKK1分子水平與T2DM人群的Hb A1c水平呈正相關(guān)。結(jié)論經(jīng)典Wnt通路下游基因β-catenin,c-myc,cyclin D1的表達水平在T2DM及DPN患者中降低,而其負性調(diào)控分子DKK1在DPN患者中異常高表達,且與Hb A1c水平有顯著相關(guān)性,提示經(jīng)典的Wnt信號通路功能降低可能促進DPN的發(fā)生。第二部分探究體內(nèi)抑制經(jīng)典的Wnt信號通路對DPN發(fā)生的影響目的通過構(gòu)建T2DM小鼠模型,小鼠灌胃給藥Wnt通路抑制劑C59,觀察抑制經(jīng)典的Wnt信號通路后對DPN發(fā)生發(fā)展的影響。方法1.T2DM小鼠模型的建立:4周齡C57B6小鼠,體重13-15 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機數(shù)字表法選取6只以標準小鼠飼料(Normal chow diet)飲食作為基礎(chǔ)對照組,即為Chow-NC組;其余小鼠,60%脂肪含量的高脂飲食喂養(yǎng)四周后,禁食14小時,按照40 mg/(kg·d)注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液,連續(xù)注射5天。注射STZ后飲用10%蔗糖水3天,10天后尾尖采血測血糖,3次隨機血糖16.9 mmol/L視為造模成功。2.小鼠分組:將T2DM小鼠按照隨機數(shù)字表分為2組,1組灌胃給藥生理鹽水,作為對照,即為T2DM-NC組;1組灌胃給藥Wnt通路抑制劑C59 10 mg/(kg·d)每2天注射一次,即為T2DM-C59組,高脂喂養(yǎng)持續(xù)至實驗終點。3.觀察小鼠毛色、精神狀態(tài)、日�；顒印嬎帮嬍城闆r等。記錄四組小鼠第4、8、14、17、19、21周體重,禁食12小時后,尾靜脈剪尾取血檢測小鼠空腹血糖。4.小鼠后肢痛覺檢測:固定檢測小鼠右后肢足底,刺激強度為35%,刺激次數(shù)3次,每次間隔30分鐘,記錄小鼠縮爪時間。每四周檢測一次,直至實驗終點。5.運動能力的檢測:以17 m/min,30分鐘時長,記錄小鼠被電擊次數(shù),每四周檢測一次,直至實驗終點。6.實驗動物取材:至實驗終點時,小鼠禁食12小時,7%水合氯醛麻醉后,小鼠眼球取血,使用一次性負壓采血管EDTAK2抗凝,以4℃,5000 r/min,離心20分鐘,獲得上清液,分裝于Ep管中,-80℃冰箱凍存待用。小鼠仰臥位固定于操作臺上,皮膚消毒后,于股骨干前外側(cè)剪開小鼠皮膚,充分暴露,取小鼠腿部肌肉,置于凍存管液氮速凍,用于分子生物學(xué)檢測。7.檢測血清中血清胰島素含量、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、總膽汁酸濃度。結(jié)果1.造模小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗、高血糖、血脂紊亂等T2DM主要臨床特征。因腹腔注射STZ會導(dǎo)致胰島細胞受到損傷,因此高脂組體重略低于正常對照組,且高脂組小鼠體重增長緩慢,血糖升高,符合糖尿病表現(xiàn),表明T2DM小鼠模型造模成功。2.抑制內(nèi)源性經(jīng)典的Wnt信號通路后,小鼠空腹血清胰島素水平、TG、C-THO、LDL較高(P0.05),小鼠血糖及血脂代謝紊亂更為嚴重,胰島素抵抗更為顯著。3.肝臟油紅O染色結(jié)果顯示:抑制經(jīng)典的Wnt信號通路后,小鼠肝細胞空隙變大,肝索排列紊亂,肝細胞內(nèi)可見的紅色脂滴明顯增多,表明肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積更為嚴重。4.通過對小鼠足底熱刺痛以及運動能力的檢測,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的Wnt信號通路受到抑制后,小鼠對熱痛刺激的反應(yīng)時間延長,運動耐力明顯下降。結(jié)論抑制內(nèi)源性經(jīng)典的Wnt信號通路,小鼠血糖及血脂代謝紊亂,胰島素抵抗顯著,周圍神經(jīng)的受損程度加劇,導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)功能障礙,使運動耐力進一步下降。第三部分揭示抑制經(jīng)典Wnt信號通路促進DPN發(fā)生的分子機制目的以兩組小鼠骨骼肌作為研究對象,探究經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在兩組小鼠中的表達差異,以及促進DPN發(fā)生發(fā)展的分子機制。方法1.使用Trizol法提取肌肉組織總RNA并測定其純度和含量,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到RNA的c DNA。2.利用Real-Time PCR技術(shù)及經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子c-myc,cyclin D1,VDL1,FZD7的正向引物和反向引物進行擴增,同時擴增β-actin基因作為對照,分析經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在兩組小鼠中的表達差異。Western blot進一步驗證經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子的蛋白表達情況。3.利用RNA轉(zhuǎn)錄組深度測序檢測兩組小鼠骨骼肌基因表達譜的變化。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測影響DPN發(fā)生發(fā)展的靶基因及分子通路。4.利用雙夾心ELISA法檢測三組人群血清中IL-6、HIF-1α水平,利用三組人群的臨床血液生化數(shù)據(jù),分析IL-6、HIF-1α水平與Hb A1c之間的相關(guān)性。5.利用Real-Time PCR、Western blot等技術(shù)檢測三組人群外周血、小鼠骨骼肌組織中線粒體拷貝數(shù)及ATP含量等指標的變化,驗證抑制該通路促進DPN發(fā)生發(fā)展的分子機制。結(jié)果1.Real-Time PCR結(jié)果顯示,抑制經(jīng)典Wnt通路后其關(guān)鍵基因c-myc、cyclin D1的表達量下降(P0.05);Western Blot結(jié)果也進一步證實,抑制經(jīng)典Wnt通路后磷酸化β-catenin與總β-catenin比值升高(P0.05)。說明作用Wnt-C59通過抑制經(jīng)典Wnt通路中關(guān)鍵基因的表達干擾了經(jīng)典Wnt通路的正常傳導(dǎo)。2.根據(jù)深度測序結(jié)果及生物信息學(xué)分析,確定抑制經(jīng)典Wnt通路促進DPN發(fā)生發(fā)展的具體信號通路。3.與對照組相比,IL-6、HIF-1α在T2DM及DPN患者中表達升高(P0.05),在DPN患者中降低更為顯著,且血清中IL-6、HIF-1α水平與糖尿病人群的Hb A1c顯著相關(guān)。4.抑制經(jīng)典Wnt通路后,HIF-1代謝通路中的關(guān)鍵分子,IL-6的m RNA表達升高(P0.05);磷酸化STAT3與總STAT3比值升高(P0.05),同時HIF-1αm RNA的表達也明顯升高(P0.05)。說明抑制經(jīng)典Wnt通路會誘導(dǎo)IL-6炎癥因子的過量表達并活化STAT3蛋白,促使HIF-1α表達增加;并進一步下調(diào)TFAM的表達及mt DNA拷貝數(shù)(P0.05),抑制線粒體的呼吸氧化功能及ATP的生成,加重周圍神經(jīng)的受損程度。結(jié)論抑制經(jīng)典Wnt通路,能夠激活I(lǐng)L-6/STAT3/HIF-1α信號代謝通路,誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子表達增加,進一步降低TFAM的表達水平及mt DNA的拷貝數(shù),抑制線粒體呼吸氧化功能和ATP生成,促進DPN的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

圖 1. 1 經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子在三組人群外周血液中表達情況注：A. β-catenin 在三組人群中的表達情況；B. c-myc 在三組人群中的表達情況；C. cyclinD1在三組人群中的表達情況；D. DKK1 在三組人群中的表達情況；β-catenin：β-連環(huán)蛋白；cyclinD1：G1/S-特異性周期蛋白-D1；c-myc：myc 癌基因；DKK-1：Dickkopf-1，Wnt 通路特異性抑制劑；與 Normol 組比#，P < 0.05；與 T2DM 組比*，P < 0.054.2 經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵基因表達水平與糖尿病人群 HbA1c 顯著相關(guān)收集實驗組的血液生化檢驗數(shù)據(jù)，整理出 HbA1c 檢測值。分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子 β-catenin,c-myc,cyclinD1 表達水平與糖尿病人群的 HbA1c呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），而 DKK1 表達水平與個體的 HbA1c 呈正相關(guān)（P＜0.05）。說明經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子的表達水平與 T2DM 的發(fā)病程度呈顯著相關(guān)性，或可作為用于臨床診斷 T2DM 的新的分子標志物。為進一步揭示經(jīng)典 Wnt通路關(guān)鍵分子與 T2DM 及 DPN 發(fā)生之間的關(guān)系，我們需要尋找 T2DM 發(fā)生過程中經(jīng)典 Wnt 通路可能直接作用的靶基因或信號通路。

圖 1. 2 經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子表達水平與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性分析注：A. β-catenin 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性；B. c-myc 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性；C. cyclinD1 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性；D. DKK1 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性5 討論糖尿病患者持續(xù)的高血糖激活多醇葡萄糖代謝通路，導(dǎo)致上皮細胞功能紊亂，細胞中毒性代謝物增多，引起以周圍神經(jīng)病變?yōu)榛A(chǔ)的全身多部位神經(jīng)損傷[10]。近年來研究表明，經(jīng)典的 Wnt 信號通路，與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，在神經(jīng)管的形成、背根神經(jīng)節(jié)及中腦的發(fā)育中有重要作用[8]，經(jīng)典的 Wnt 信號通路激活后在髓鞘再生和軸突再生過程中具有促進作用[9]。Wnt 通路受多種拮抗劑或調(diào)節(jié)劑家族調(diào)控，包括分泌卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled related protein,sFRP）和dickkopfs（dickkopfs, DKK）以及 Wnt 抑制因子-1（Wnt inhibitor-1, WIF1）[11-13]。Dickkopf-1（DKK-1）是 Wnt 信號通路的一種成熟的特異性抑制劑[14]，據(jù)報道，DKK-1 mRNA 在大多數(shù)正常人類組織，如心臟、肝臟、肺、腎臟、大腦和骨髓

第二部分 探究體內(nèi)抑制經(jīng)典 Wnt 信號通路對 DPN 發(fā)生的影響4.1 體內(nèi)抑制經(jīng)典 Wnt 通路后小鼠體重降低、肝重增加如圖所示，4-21 周期間，與 Chow-NC 組小鼠相比，T2DM 組小鼠體重減低，且 T2DM-C59 組小鼠降低更為顯著（P<0.05，圖 2.1 A）；T2DM 組小鼠平均肝重較高，且 T2DM-C59 組小鼠更為顯著（P<0.05，圖 2.1 C）；至實驗終點時，T2DM組小鼠肝重/體重比值較高（P<0.05，圖 2.1 B），且 T2DM-C59 組小鼠更為顯著。因腹腔注射 STZ 會導(dǎo)致胰島細胞受到損傷，糖代謝紊亂，加重體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的異常分解，因此高脂組體重略低于正常對照組，且 T2DM-C59 組小鼠體重增長更為緩慢。4 結(jié)果
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李釗至;呂敏;梁魏;梁能堂;秦小云;夏春波;王俊鋒;陳晨;;糖尿病大鼠模型的建立及評價[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2017年01期

2 施明美;戴素俊;任琴;劉小麗;趙良才;;1型和2型糖尿病大鼠模型血清氨基酸含量比較[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2017年01期

3 邵俊偉;蔡遜;;高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的研究進展[J];中國實驗動物學(xué)報;2014年04期

4 顧曉穎;杜佳林;;2型糖尿病大鼠模型建立的研究述略[J];實用中醫(yī)內(nèi)科雜志;2009年11期

5 曾新生;姚微微;丁芝祥;李政;高翔;孫建國;彭燕一;;腹腔注射鏈脲佐菌素構(gòu)建糖尿病大鼠模型[J];華夏醫(yī)學(xué);2013年05期

6 雙衛(wèi)兵,王志慧,王東文,吳博威;2型糖尿病大鼠模型的制備及其驗證[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2005年03期

7 郭延敏;;鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年15期

8 曹石金;何朝輝;李遜;魯雄兵;何永忠;;糖尿病大鼠模型的制備[J];解剖學(xué)研究;2012年04期

9 朱建華;苗琳;馬術(shù)明;李維善;胡靜;劉繼光;;核因子-κΒ在不同時期糖尿病大鼠模型頜下腺表達的研究[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2011年11期

10 燕娟;郭巍偉;梁執(zhí)群;李志國;郭永昌;;2型糖尿病大鼠模型的建立及其驗證[J];臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志;2009年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 張聞宇;酰基輔酶A：膽固醇�；D(zhuǎn)移酶2在2型糖尿病血脂異常中作用機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2006年

2 李曉魯;線粒體偶聯(lián)因子6在糖尿病中的臨床意義及其機制研究[D];山東大學(xué);2007年

3 李宏;選擇性腺苷A2B受體拮抗劑短期治療糖尿病大鼠模型對胰島素敏感性的影響[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

4 劉進娜;2型糖尿病大鼠模型的中醫(yī)證候演變及中藥干預(yù)的方證相關(guān)性研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

5 向雪松;2型糖尿病大鼠模型的建立及其在輔助降血糖功能評價中的應(yīng)用[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2010年

6 蔣婷婷;褪黑素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護作用及機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 吳昊;運動、降糖物質(zhì)干預(yù)對“糖尿病大鼠模型”轉(zhuǎn)歸影響的多因素研究——代謝系統(tǒng)應(yīng)答與胰島β細胞功能的調(diào)控機制[D];北京體育大學(xué);2001年

8 謝婷玉;臭氧對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激、炎癥相關(guān)因子及Müller細胞功能的影響[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2016年

9 王妍;五甲基槲皮素及胃袖狀切除術(shù)對乳鼠腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型的效應(yīng)研究[D];華中科技大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張珍;抑制經(jīng)典Wnt通路促進糖尿病神經(jīng)病變發(fā)生的分子機制研究[D];鄭州大學(xué);2019年

2 劉莉華;糖尿病腎臟病患者血炎癥因子的變化及其臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2017年

3 黃琦;金釵石斛總生物堿對糖尿病大鼠模型的保護作用[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2009年

4 曾艷;地黃寡糖在2型糖尿病大鼠模型上的降血糖作用及機制研究[D];蘭州大學(xué);2006年

5 楊雪;巖藻多糖在2型糖尿病大鼠模型的作用研究[D];青島大學(xué);2010年

6 汪凌云;豹皮樟總黃酮治療2型糖尿病大鼠模型的機制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

7 劉真序;運動對糖尿病大鼠模型建立的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

8 張曉明;糖尿病大鼠模型中樞生長抑素表達的觀察研究[D];浙江大學(xué);2001年

9 王爽;糖尿病足患者血清熱激蛋白70的水平變化及其相關(guān)因素分析[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2017年

10 謝勝;Rpe65基因、Rod CNG Channel基因在糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜上的表達變化和相關(guān)作用研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號：2878710