2017年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,目前全球有4.25億人罹患糖尿病,糖尿病已成為21世紀(jì)全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,嚴(yán)重影響人類的生命健康。而糖尿病周圍神經(jīng)病變作為最常見(jiàn)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一,可以引起反復(fù)下肢感染、潰瘍、非創(chuàng)傷性截肢等,花費(fèi)巨大,致殘率高,嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在代謝性疾病的發(fā)生中也發(fā)揮著廣泛的作用。參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化,胰腺器官發(fā)育,胰島β細(xì)胞分化,胰島素的合成和分泌等,對(duì)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的出現(xiàn)起著重要的作用。近年來(lái)研究表明,經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān),在神經(jīng)管的形成、背根神經(jīng)節(jié)及中腦的發(fā)育中有重要作用。但經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路與糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)系并不清楚,因此深入研究經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與DPN發(fā)生的關(guān)系并揭示作用機(jī)制,對(duì)于防治糖尿病周圍神經(jīng)病變具有重要的臨床意義。第一部分確定經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因在DPN患者中表達(dá)情況的變化目的以正常人群、無(wú)DPN的糖尿病患者及并發(fā)DPN的糖尿病患者空腹外周血液作為研究對(duì)象,探究經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在這三組人群中表達(dá)的差異,并分析其表達(dá)水平與糖尿病臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。方法1.自2017年12月-2018年5月,按照糖尿病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和DPN診斷標(biāo)準(zhǔn),收集正常人群、無(wú)DPN的糖尿病患者及并發(fā)DPN的糖尿病患者的空腹外周血液,外周血EDTAK2抗凝處理后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆�。同時(shí)收集三組人群的臨床生化檢測(cè)數(shù)據(jù)及T2DM患者的病歷資料。2.提取血液總RNA并測(cè)定其純度和含量,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到RNA的c DNA。3.利用Real-Time PCR技術(shù)及經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin,c-myc,cyclin D1,DKK1的正向和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增內(nèi)參基因β-actin作為對(duì)照,分析經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在三組人群中的表達(dá)差異。4.分析經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平與Hb A1c之間的相關(guān)性。結(jié)果1.經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在三組人群中的表達(dá)差異:Real-Time PCR結(jié)果顯示,β-catenin,c-myc,cyclin D1在T2DM及DPN患者中表達(dá)降低(P0.05),而DKK1在T2DM及DPN患者中表達(dá)升高(P0.05),且在DPN患者中更甚。2.β-catenin,c-myc,cyclin D1分子水平與T2DM人群的Hb A1c呈負(fù)相關(guān),DKK1分子水平與T2DM人群的Hb A1c水平呈正相關(guān)。結(jié)論經(jīng)典Wnt通路下游基因β-catenin,c-myc,cyclin D1的表達(dá)水平在T2DM及DPN患者中降低,而其負(fù)性調(diào)控分子DKK1在DPN患者中異常高表達(dá),且與Hb A1c水平有顯著相關(guān)性,提示經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路功能降低可能促進(jìn)DPN的發(fā)生。第二部分探究體內(nèi)抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路對(duì)DPN發(fā)生的影響目的通過(guò)構(gòu)建T2DM小鼠模型,小鼠灌胃給藥Wnt通路抑制劑C59,觀察抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路后對(duì)DPN發(fā)生發(fā)展的影響。方法1.T2DM小鼠模型的建立:4周齡C57B6小鼠,體重13-15 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)數(shù)字表法選取6只以標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料(Normal chow diet)飲食作為基礎(chǔ)對(duì)照組,即為Chow-NC組;其余小鼠,60%脂肪含量的高脂飲食喂養(yǎng)四周后,禁食14小時(shí),按照40 mg/(kg·d)注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液,連續(xù)注射5天。注射STZ后飲用10%蔗糖水3天,10天后尾尖采血測(cè)血糖,3次隨機(jī)血糖16.9 mmol/L視為造模成功。2.小鼠分組:將T2DM小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為2組,1組灌胃給藥生理鹽水,作為對(duì)照,即為T(mén)2DM-NC組;1組灌胃給藥Wnt通路抑制劑C59 10 mg/(kg·d)每2天注射一次,即為T(mén)2DM-C59組,高脂喂養(yǎng)持續(xù)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。3.觀察小鼠毛色、精神狀態(tài)、日�；顒�(dòng)、飲水及飲食情況等。記錄四組小鼠第4、8、14、17、19、21周體重,禁食12小時(shí)后,尾靜脈剪尾取血檢測(cè)小鼠空腹血糖。4.小鼠后肢痛覺(jué)檢測(cè):固定檢測(cè)小鼠右后肢足底,刺激強(qiáng)度為35%,刺激次數(shù)3次,每次間隔30分鐘,記錄小鼠縮爪時(shí)間。每四周檢測(cè)一次,直至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。5.運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè):以17 m/min,30分鐘時(shí)長(zhǎng),記錄小鼠被電擊次數(shù),每四周檢測(cè)一次,直至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。6.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材:至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí),小鼠禁食12小時(shí),7%水合氯醛麻醉后,小鼠眼球取血,使用一次性負(fù)壓采血管EDTAK2抗凝,以4℃,5000 r/min,離心20分鐘,獲得上清液,分裝于Ep管中,-80℃冰箱凍存待用。小鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上,皮膚消毒后,于股骨干前外側(cè)剪開(kāi)小鼠皮膚,充分暴露,取小鼠腿部肌肉,置于凍存管液氮速凍,用于分子生物學(xué)檢測(cè)。7.檢測(cè)血清中血清胰島素含量、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、總膽汁酸濃度。結(jié)果1.造模小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗、高血糖、血脂紊亂等T2DM主要臨床特征。因腹腔注射STZ會(huì)導(dǎo)致胰島細(xì)胞受到損傷,因此高脂組體重略低于正常對(duì)照組,且高脂組小鼠體重增長(zhǎng)緩慢,血糖升高,符合糖尿病表現(xiàn),表明T2DM小鼠模型造模成功。2.抑制內(nèi)源性經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路后,小鼠空腹血清胰島素水平、TG、C-THO、LDL較高(P0.05),小鼠血糖及血脂代謝紊亂更為嚴(yán)重,胰島素抵抗更為顯著。3.肝臟油紅O染色結(jié)果顯示:抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路后,小鼠肝細(xì)胞空隙變大,肝索排列紊亂,肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)的紅色脂滴明顯增多,表明肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積更為嚴(yán)重。4.通過(guò)對(duì)小鼠足底熱刺痛以及運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路受到抑制后,小鼠對(duì)熱痛刺激的反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),運(yùn)動(dòng)耐力明顯下降。結(jié)論抑制內(nèi)源性經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路,小鼠血糖及血脂代謝紊亂,胰島素抵抗顯著,周圍神經(jīng)的受損程度加劇,導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能障礙,使運(yùn)動(dòng)耐力進(jìn)一步下降。第三部分揭示抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)DPN發(fā)生的分子機(jī)制目的以兩組小鼠骨骼肌作為研究對(duì)象,探究經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在兩組小鼠中的表達(dá)差異,以及促進(jìn)DPN發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。方法1.使用Trizol法提取肌肉組織總RNA并測(cè)定其純度和含量,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到RNA的c DNA。2.利用Real-Time PCR技術(shù)及經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子c-myc,cyclin D1,VDL1,FZD7的正向引物和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增,同時(shí)擴(kuò)增β-actin基因作為對(duì)照,分析經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子在兩組小鼠中的表達(dá)差異。Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證經(jīng)典Wnt通路關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)情況。3.利用RNA轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序檢測(cè)兩組小鼠骨骼肌基因表達(dá)譜的變化。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)影響DPN發(fā)生發(fā)展的靶基因及分子通路。4.利用雙夾心ELISA法檢測(cè)三組人群血清中IL-6、HIF-1α水平,利用三組人群的臨床血液生化數(shù)據(jù),分析IL-6、HIF-1α水平與Hb A1c之間的相關(guān)性。5.利用Real-Time PCR、Western blot等技術(shù)檢測(cè)三組人群外周血、小鼠骨骼肌組織中線粒體拷貝數(shù)及ATP含量等指標(biāo)的變化,驗(yàn)證抑制該通路促進(jìn)DPN發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。結(jié)果1.Real-Time PCR結(jié)果顯示,抑制經(jīng)典Wnt通路后其關(guān)鍵基因c-myc、cyclin D1的表達(dá)量下降(P0.05);Western Blot結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí),抑制經(jīng)典Wnt通路后磷酸化β-catenin與總β-catenin比值升高(P0.05)。說(shuō)明作用Wnt-C59通過(guò)抑制經(jīng)典Wnt通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)干擾了經(jīng)典Wnt通路的正常傳導(dǎo)。2.根據(jù)深度測(cè)序結(jié)果及生物信息學(xué)分析,確定抑制經(jīng)典Wnt通路促進(jìn)DPN發(fā)生發(fā)展的具體信號(hào)通路。3.與對(duì)照組相比,IL-6、HIF-1α在T2DM及DPN患者中表達(dá)升高(P0.05),在DPN患者中降低更為顯著,且血清中IL-6、HIF-1α水平與糖尿病人群的Hb A1c顯著相關(guān)。4.抑制經(jīng)典Wnt通路后,HIF-1代謝通路中的關(guān)鍵分子,IL-6的m RNA表達(dá)升高(P0.05);磷酸化STAT3與總STAT3比值升高(P0.05),同時(shí)HIF-1αm RNA的表達(dá)也明顯升高(P0.05)。說(shuō)明抑制經(jīng)典Wnt通路會(huì)誘導(dǎo)IL-6炎癥因子的過(guò)量表達(dá)并活化STAT3蛋白,促使HIF-1α表達(dá)增加;并進(jìn)一步下調(diào)TFAM的表達(dá)及mt DNA拷貝數(shù)(P0.05),抑制線粒體的呼吸氧化功能及ATP的生成,加重周圍神經(jīng)的受損程度。結(jié)論抑制經(jīng)典Wnt通路,能夠激活I(lǐng)L-6/STAT3/HIF-1α信號(hào)代謝通路,誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)增加,進(jìn)一步降低TFAM的表達(dá)水平及mt DNA的拷貝數(shù),抑制線粒體呼吸氧化功能和ATP生成,促進(jìn)DPN的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

圖 1. 1 經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子在三組人群外周血液中表達(dá)情況注：A. β-catenin 在三組人群中的表達(dá)情況；B. c-myc 在三組人群中的表達(dá)情況；C. cyclinD1在三組人群中的表達(dá)情況；D. DKK1 在三組人群中的表達(dá)情況；β-catenin：β-連環(huán)蛋白；cyclinD1：G1/S-特異性周期蛋白-D1；c-myc：myc 癌基因；DKK-1：Dickkopf-1，Wnt 通路特異性抑制劑；與 Normol 組比#，P < 0.05；與 T2DM 組比*，P < 0.054.2 經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平與糖尿病人群 HbA1c 顯著相關(guān)收集實(shí)驗(yàn)組的血液生化檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，整理出 HbA1c 檢測(cè)值。分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子 β-catenin,c-myc,cyclinD1 表達(dá)水平與糖尿病人群的 HbA1c呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而 DKK1 表達(dá)水平與個(gè)體的 HbA1c 呈正相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平與 T2DM 的發(fā)病程度呈顯著相關(guān)性，或可作為用于臨床診斷 T2DM 的新的分子標(biāo)志物。為進(jìn)一步揭示經(jīng)典 Wnt通路關(guān)鍵分子與 T2DM 及 DPN 發(fā)生之間的關(guān)系，我們需要尋找 T2DM 發(fā)生過(guò)程中經(jīng)典 Wnt 通路可能直接作用的靶基因或信號(hào)通路。

圖 1. 2 經(jīng)典 Wnt 通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性分析注：A. β-catenin 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性；B. c-myc 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性；C. cyclinD1 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性；D. DKK1 與糖尿病人群 HbA1c 的相關(guān)性5 討論糖尿病患者持續(xù)的高血糖激活多醇葡萄糖代謝通路，導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能紊亂，細(xì)胞中毒性代謝物增多，引起以周圍神經(jīng)病變?yōu)榛A(chǔ)的全身多部位神經(jīng)損傷[10]。近年來(lái)研究表明，經(jīng)典的 Wnt 信號(hào)通路，與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，在神經(jīng)管的形成、背根神經(jīng)節(jié)及中腦的發(fā)育中有重要作用[8]，經(jīng)典的 Wnt 信號(hào)通路激活后在髓鞘再生和軸突再生過(guò)程中具有促進(jìn)作用[9]。Wnt 通路受多種拮抗劑或調(diào)節(jié)劑家族調(diào)控，包括分泌卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled related protein,sFRP）和dickkopfs（dickkopfs, DKK）以及 Wnt 抑制因子-1（Wnt inhibitor-1, WIF1）[11-13]。Dickkopf-1（DKK-1）是 Wnt 信號(hào)通路的一種成熟的特異性抑制劑[14]，據(jù)報(bào)道，DKK-1 mRNA 在大多數(shù)正常人類組織，如心臟、肝臟、肺、腎臟、大腦和骨髓

第二部分 探究體內(nèi)抑制經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路對(duì) DPN 發(fā)生的影響4.1 體內(nèi)抑制經(jīng)典 Wnt 通路后小鼠體重降低、肝重增加如圖所示，4-21 周期間，與 Chow-NC 組小鼠相比，T2DM 組小鼠體重減低，且 T2DM-C59 組小鼠降低更為顯著（P<0.05，圖 2.1 A）；T2DM 組小鼠平均肝重較高，且 T2DM-C59 組小鼠更為顯著（P<0.05，圖 2.1 C）；至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，T2DM組小鼠肝重/體重比值較高（P<0.05，圖 2.1 B），且 T2DM-C59 組小鼠更為顯著。因腹腔注射 STZ 會(huì)導(dǎo)致胰島細(xì)胞受到損傷，糖代謝紊亂，加重體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的異常分解，因此高脂組體重略低于正常對(duì)照組，且 T2DM-C59 組小鼠體重增長(zhǎng)更為緩慢。4 結(jié)果
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