目的:哮喘是以氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為主要特征的、嚴(yán)重危害公眾健康的呼吸道疾病。目前全球范圍內(nèi)約有23,500到33,400萬哮喘患者,每年約有25萬人死于哮喘。在我國,哮喘總患病率約為1.24%,且近年來具有明顯上升趨勢。包括嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞在內(nèi)的固有免疫細(xì)胞,以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞如Th2細(xì)胞參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。這些免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在誘導(dǎo)哮喘形成和加重呼吸道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者存在炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的異常表達(dá),例如胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、白細(xì)胞介素-33(Interleukin-33,IL-33,)、IL-31、IL-4等均可能通過影響血清IgE水平及肺組織內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,參與氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。有文獻(xiàn)報道胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素可以激活樹突狀細(xì)胞和啟動Th2型免疫應(yīng)答,在哮喘炎癥階段尤其是炎癥早期發(fā)揮作用;白細(xì)胞介素-33可以活化和募集巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的成熟和生存,并促進(jìn)肥大細(xì)胞分泌高水平IL-13;而總所周知的經(jīng)典的Th2型細(xì)胞因子IL-4是誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子。近年來研究證實IL-31亦是哮喘的重要參與因子。但迄今為止,包括TSLP、IL-33、IL-31等在內(nèi)的細(xì)胞因子在臨床哮喘患者、鼻炎患者、以及哮喘合并鼻炎患者中的表達(dá)情況,及其統(tǒng)計比較的相關(guān)數(shù)據(jù)尚不充分。IL-4、IL-31、IL-33、TSLP的表達(dá)與哮喘、鼻炎和哮喘合并鼻炎的關(guān)聯(lián)度有多少?過敏性與非過敏性患者血清內(nèi)IL-4、IL-31、IL-33和TSLP的表達(dá)水平是否具有差異?各種過敏因素(塵螨、艾草、霉菌、食物、蟑螂)對這幾種因子的產(chǎn)生是否有影響?這些問題值得深入研究和探討。在誘導(dǎo)哮喘形成和發(fā)作的諸多誘因中,病毒感染尤其是呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)感染尤為重要。盡管有研究表明RSV感染可能通過誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分泌更多的Th2型細(xì)胞因子進(jìn)而誘發(fā)或加重哮喘,但常規(guī)的哮喘治療藥物對其治療效果不佳,提示在RSV感染誘發(fā)哮喘的發(fā)生發(fā)展中存在著不同于Th2型細(xì)胞的某些致病機(jī)制或途徑。2型固有淋巴細(xì)胞(Group 2 innate lymphoid cells,ILC2s)亦稱天然輔助細(xì)胞,是新近發(fā)現(xiàn)的非T非B的固有淋巴細(xì)胞,其主要生物學(xué)作用是通過分泌Th2型細(xì)胞因子參與過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn),流感病毒感染能導(dǎo)致實驗鼠氣道反應(yīng)性顯著升高。該升高的氣道反應(yīng)性與適應(yīng)性應(yīng)答無關(guān),但卻依賴于2型固有淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子尤其是IL-13。研究發(fā)現(xiàn)卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型中,肺組織局部ILC2s是IL-5和IL-13的重要來源細(xì)胞,提示2型固有淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)生中的關(guān)鍵作用。然而,2型固有淋巴細(xì)胞是否參與呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的急性哮喘,其生物學(xué)活性及作用機(jī)制如何,目前尚不清楚。研究表明IL-33在誘導(dǎo)ILC2s活化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。那么,在RSV感染誘發(fā)急性哮喘發(fā)生中,ILC2s是否通過IL-33的刺激而活化,進(jìn)而分泌哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子?目前尚不清楚。本課題以臨床患者為研究對象,比對分析哮喘合并或不合并鼻炎患者血清中IL-33、IL-31、IL-4和TSLP等炎性因子血清水平,探討其與疾病進(jìn)展程度的相關(guān)性,為發(fā)現(xiàn)及尋找更多的哮喘輔助診斷指標(biāo)和治療效果判定指標(biāo)提供實驗依據(jù)。另外通過利用RSV感染誘導(dǎo)的急性哮喘鼠模型,揭示作為IL-33作用靶細(xì)胞的2型固有淋巴細(xì)胞在RSV哮喘中的生物學(xué)作用及其活化機(jī)制,為深入了解哮喘免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制,闡明固有免疫細(xì)胞在哮喘,尤其是病毒感染誘發(fā)的非過敏性哮喘中的作用地位,提供實驗佐證。研究方法:1、臨床患者的篩選:本研究132例患者均為2015年10月至2016年5月期間在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院過敏科接受治療的患者。哮喘、鼻炎及哮喘合并鼻炎患者各64例,并依據(jù)其血清IgE表達(dá)情況將其進(jìn)一步分為s IgE[+]和s IgE[-]患者。32例健康個體來自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院健康中心。2、患者外周血的采集:所有患者均在清晨采集靜脈血5 mL。3、塵螨或艾蒿過敏實驗動物模型:6~8周齡雌性C57BL/6小鼠,在實驗的第0、7和14天,腹腔注射塵螨或艾蒿提取物致敏小鼠。從第28天起連續(xù)7天用塵螨或艾蒿提取物激發(fā)致敏鼠。觀察并記錄各組哮喘癥狀。取血清和肺組織進(jìn)行實驗。4、RSV感染誘發(fā)的BALB/c鼠急性哮喘模型:用2×10~6 TCID50/鼠的RSV經(jīng)鼻感染BALB/c鼠。部分小鼠在RSV感染前2 h腹腔注射200μg的anti-IL-33中和抗體以阻斷IL-33的作用。5、氣道炎癥反應(yīng):使用1 mL PBS灌洗肺組織,搜集支氣管肺泡灌洗液。離心后將細(xì)胞沉淀用PBS重懸,計數(shù)細(xì)胞總數(shù)并制備細(xì)胞涂片。瑞氏-吉姆薩染色后顯微鏡下隨機(jī)選擇視野,計數(shù)200個細(xì)胞,并依據(jù)形態(tài)學(xué)特點分別計數(shù)不同類別白細(xì)胞數(shù)量及其百分比。6、肺單細(xì)胞懸液的制備:取肺組織剪碎后,將其加入含有Collagenase D(200μl 10mg/m L)和DNaseⅠ(40μl 10mg/mL)的培養(yǎng)液中,37℃搖床內(nèi)震蕩90 min。消化完成后,使用不銹鋼濾網(wǎng)過濾并離心。加紅細(xì)胞裂解液于細(xì)胞沉淀以裂解紅細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞后用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。7、流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織內(nèi)ILC2s數(shù)量:利用CD16/32抗體封閉細(xì)胞表面Fc受體以減少非特異性染色。之后加入不同熒光素標(biāo)記的lineage cocktail、anti-CD45及anti-ST2單克隆抗體。冰上避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀分析500,000個細(xì)胞,其中表型為CD45~+Lin~-ST2~+的細(xì)胞在本研究中被認(rèn)定為ILC2s細(xì)胞。8、肺ILC2s過繼回輸實驗:免疫磁珠分選感染RSV第3天的BALB/c鼠肺ILC2s。RSV感染前2小時,將2×10~4個ILC2s細(xì)胞(純度90%)經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。9、利用ELISA檢測試劑盒檢測患者血清以及模型鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-10、IL-31、IL-33、IFN-γ以及TSLP水平。10、利用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測患者外周血細(xì)胞及模型鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-31、IL-33、IFN-γ以及TSLP mRNA表達(dá)水平。11、利用Western blot方法,檢測塵螨或艾蒿致敏鼠肺組織內(nèi)IL-4、IL-31、IL-33以及TSLP蛋白水平。12、統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)均用PRISM 6.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間比較使用χ~2分析或t檢驗。P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1、哮喘、鼻炎、哮喘合并鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31、IL-33和TSLP表達(dá)水平明顯升高:利用ELISA及Real-time RT-PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn),哮喘、鼻炎、哮喘合并鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31、IL-33和TSLP的表達(dá)水平均明顯高于正常人。然而,在sIgE[+]和s IgE[-]的患者之間,IL-4、IL-31、IL-33和TSLP表達(dá)水平無顯著性差異。2、塵螨和艾蒿促進(jìn)哮喘患者、鼻炎患者IL-4、IL-31,IL-33和TSLP的分泌:通過分析對不同過敏原過敏的哮喘患者、鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31,IL-33和TSLP表達(dá)水平的差異,證實塵螨和艾蒿可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生更高水平的IL-4、IL-31、IL-33和TSLP。3、塵螨和艾蒿可以增加哮喘模型鼠IL-4、IL-31,IL-33和TSLP的表達(dá)水平:通過比較塵螨、艾蒿致敏鼠和對照鼠血清和肺組織內(nèi)IL-4,IL-31,IL-33和TSLP表達(dá)水平,證實塵螨和艾蒿是誘導(dǎo)IL-4、IL-33和IL-31,TSLP產(chǎn)生的重要過敏原。4、在RSV感染發(fā)生過程中,肺組織內(nèi)ILC2s是Th2型細(xì)胞因子的主要來源細(xì)胞:利用實時定量RT-PCR方法,檢測肺組織內(nèi)ILC2s Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明,RSV感染后肺組織內(nèi)ILC2s細(xì)胞IL-4、IL-5和IL-10的表達(dá)水平顯著增加,尤其是在感染早期,這種增加更為顯著。然而,在病毒感染過程中,并未發(fā)現(xiàn)2型固有淋巴細(xì)胞IFN-γ表達(dá)水平的明顯上調(diào),提示在RSV感染過程中,2型固有淋巴細(xì)胞可能通過分泌Th2型細(xì)胞因子建立優(yōu)勢Th2型應(yīng)答,進(jìn)而參與哮喘的形成和發(fā)展。5、ILC2s促進(jìn)RSV介導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng):過繼回輸實驗表明2型固有淋巴細(xì)胞可明顯加重RSV感染鼠肺組織局部炎癥反應(yīng),引起炎性細(xì)胞肺組織內(nèi)大量浸潤和氣道分泌液明顯增多。盡管過繼回輸ILC2s細(xì)胞不能明顯改變小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù),但顯著增加肺組織內(nèi)嗜酸細(xì)胞數(shù)量。此外,回輸肺ILC2s細(xì)胞可以增加肺組織局部Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-10的產(chǎn)生,并下調(diào)IFN-γ表達(dá),提示2型固有淋巴細(xì)胞作為促炎因素,加重病毒感染誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)。6、IL-33活化ILC2s細(xì)胞:利用單克隆抗體中和模型鼠體內(nèi)IL-33。結(jié)果顯示缺少IL-33的刺激,模型鼠肺組織局部ILC2s細(xì)胞的絕對數(shù)量明顯下降,同時其Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平亦顯著降低,提示IL-33可能通過直接或間接作用調(diào)控ILC2s活化。結(jié)論:1、臨床哮喘、鼻炎或哮喘合并鼻炎患者外周血中IL-4、IL-31,IL-33和TSLP水平明顯高于健康個體,其中塵螨和艾蒿過敏患者上述細(xì)胞因子水平升高更為明顯。2、肺組織局部2型固有淋巴細(xì)胞通過IL-33活化,進(jìn)而分泌高水平Th2型細(xì)胞因子,參與RSV感染誘發(fā)的氣道炎癥。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 哮喘患者外周血中 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 表達(dá)水平明顯升高為探討 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 在哮喘患者體內(nèi)的表達(dá)情況，我們分別檢測并且對比了 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 在正常人及過敏或非過敏哮喘患者外周血中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘患者外周血中 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 蛋白及 mRNA 表達(dá)水平均較健康群體明顯增加，但這些細(xì)胞因子的表達(dá)水平在過敏性或非過敏性哮喘患者中并無顯著性差異。結(jié)果見圖 3.1。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.2 鼻炎患者外周血中 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 表達(dá)水平顯著上升利用 ELISA 法和 Real-time RT-PCR 法，我們分別檢測并且對比了 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 在正常人及鼻炎患者外周血中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是過敏性鼻炎亦或是非過敏性鼻炎患者，其外周血中 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 表達(dá)水平均顯著上調(diào)。結(jié)果見圖 3.2。

圖 3.3 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 在哮喘合并鼻炎患者中高水平表達(dá)。The levels of IL-4, IL-31, IL-33 and TSLP were enhanced in the peripheral blood of patientswith rhinitis and asthma.圖中 Control 代表正常人對照組；sIgE(+)為患者存在過敏現(xiàn)象；sIgE(-)為患者不存在過敏現(xiàn)象。ELISA 試劑盒檢測血清中 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP 的含量（圖 A），Real-time RT-PCR法檢測外周血細(xì)胞中 IL-4、IL-31、IL-33 和 TSLP mRNA 表達(dá)水平（圖 B）。實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。組間比較采用 χ2分析。**與正常對照者相比 P＜0.05。3.4 在對不同變應(yīng)原過敏的哮喘患者外周血中 IL-4、IL-31、IL-33 和TSLP 的表達(dá)情況
【參考文獻(xiàn)】

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1 Jing-Jing Zhao;Ke Pan;Qi-Jing Wang;Zheng-Di Xu;De-Sheng Weng;Jian-Jun Li;Yong-Qiang Li;Jian-Chuan Xia;;Effect of anti-asthma Chinese medicine Chuankezhi on the anti-tumor activity of cytokine-induced killer cells[J];Chinese Journal of Cancer;2013年10期

2 惠郁;謝娟娟;李羚;項紅霞;穆會君;殷瑩;張曉娟;;哮喘兒童細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子mRNA表達(dá)與Th1/Th2的關(guān)系[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2012年10期

本文編號：2863748