目的:高脂血癥又稱脂質(zhì)代謝異常或紊亂,可分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、混合型高脂血癥,是糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥等疾病的主要誘發(fā)因素之一,臨床發(fā)病率高,嚴(yán)重危害人們的身體健康。作為高脂血癥相關(guān)的骨代謝性疾病,骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少,骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨骼疾病,常引起骨的脆性增加,容易發(fā)生骨折�？谇还鞘侨砉趋赖囊徊糠�,骨密度減低可能導(dǎo)致頜骨結(jié)構(gòu)減弱,影響義齒修復(fù)的效果,不利于種植體的骨整合�？谇还莵G失與骨質(zhì)疏松癥具有一定的相關(guān)性,是近年來學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。眾多研究認(rèn)為在頜骨組織中高脂血癥與骨密度呈反向相關(guān),低骨密度將影響種植牙的骨整合、初期穩(wěn)定性及功能。然而,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)含有甘油三脂的高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠不會(huì)導(dǎo)致骨量丟失,反而有利于骨的功能結(jié)構(gòu)。因此,研究高脂飲食對(duì)頜骨代謝的影響及機(jī)制具有重要臨床意義。細(xì)胞自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,是一種廣泛存在于真核細(xì)胞、且進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞降解過程。早在40年前就由Christian deDuve提出這一概念,但是真正在分子水平上闡明自噬的調(diào)節(jié)及機(jī)制的研究,都是在酵母中突破并完成的。到目前為止,已在酵母遺傳篩選中鑒定了 32個(gè)不同的自噬相關(guān)基因(ATG)。ATG與細(xì)胞凋亡、衰老一樣,參與機(jī)體各階段的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來發(fā)現(xiàn)自噬在不同的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞中均發(fā)揮著重要作用。自噬活性失調(diào)可能涉及骨骼相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)自噬與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系密切,自噬相關(guān)基因的變異可能影響骨的形成及重建,導(dǎo)致骨密度下降,骨質(zhì)疏松,易發(fā)生骨折。NF-κB做為轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員之一,常以同源二聚體形式存在于大部分細(xì)胞內(nèi),參與免疫反應(yīng)的早期階段和炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段,影響細(xì)胞分化、凋亡、組織損傷及應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路參與自噬活性的調(diào)控,自噬相關(guān)基因Beclin 1及ATG5的激活可導(dǎo)致NF-κB信號(hào)兩個(gè)重要的調(diào)控因子IKK及NIK降解,而自噬抑制劑3-MA能夠阻斷這一過程。然而自噬是否影響高脂血癥的頜骨骨結(jié)構(gòu),NF-κB信號(hào)通路是否參與其中,目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要從以下三個(gè)部分進(jìn)行。第一部分:高脂血癥動(dòng)物模型建立,通過長(zhǎng)時(shí)間喂養(yǎng)SD大鼠高膽固醇飲食,模擬現(xiàn)代人的高脂飲食習(xí)慣,建立高脂血癥動(dòng)物模型;第二部分:高膽固醇飲食對(duì)大鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)的影響。在此動(dòng)物模型基礎(chǔ)上,利用qPCR、免疫組化、骨組織形態(tài)計(jì)量等方法,證實(shí)高膽固醇飲食對(duì)大鼠下頜骨結(jié)構(gòu)的影響,探討NF-κB信號(hào)通路參與調(diào)控高膽固醇飲食對(duì)下頜骨結(jié)構(gòu)的改變以及辛伐他汀的治療意義;第三部分:自噬參與高膽固醇飲食大鼠下頜骨結(jié)構(gòu)改變的研究。利用qPCR、免疫組化等方法,研究在高膽固醇飲食及辛伐他汀藥物干預(yù)情況下,自噬相關(guān)基因LC3、p62在大鼠下頜骨組織中的表達(dá),分析自噬是否參與調(diào)控高膽固醇飲食對(duì)頜骨結(jié)構(gòu)的改變,以期為高脂血癥患者頜骨骨量丟失及代謝異常的治療提供一個(gè)重要靶點(diǎn),從而提高口腔種植及義齒修復(fù)的成功率,更好的滿足患者對(duì)高品質(zhì)生活的需求。方法:1.將30只SD大鼠隨機(jī)分為三組,正常飲食組(NC)、高膽固醇飲食組(HC)、5mg/kg辛伐他汀+高膽固醇飲食組(HC+SIM)。每周測(cè)量體重,喂養(yǎng)32周后取空腹12小時(shí)的靜脈血進(jìn)行生化檢測(cè)血清甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指標(biāo),建立高脂血癥動(dòng)物模型。2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法檢測(cè)NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá),分析炎癥在高膽固醇飲食大鼠中的意義。3.將大鼠下頜骨組織固定、脫鈣,HE染色,利用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行下頜骨骨組織形態(tài)計(jì)量,檢測(cè)靜態(tài)參數(shù):骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,明確高膽固醇飲食及辛伐他汀干預(yù)對(duì)大鼠頜骨微結(jié)構(gòu)的影響。4.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組化技術(shù),分別檢測(cè)NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織中RANKL、OPG基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平,分析RANKL、OPG、RANKL/OPG在高膽固醇飲食大鼠頜骨組織中的變化及辛伐他汀的干預(yù)意義。5.運(yùn)用qPCR及免疫組化技術(shù),分別檢測(cè)NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織中炎癥信號(hào)NF-1κB的mRNA及蛋白表達(dá)水平,分析NF-κB信號(hào)是否參與調(diào)控高膽固醇飲食大鼠頜骨結(jié)構(gòu)的改變。6.運(yùn)用qPCR及免疫組化技術(shù),分別檢測(cè)NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織中自噬相關(guān)基因LC3及p62的mRNA及蛋白表達(dá)水平,證實(shí)自噬是否參與高膽固醇飲食大鼠頜骨結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:1.高膽固醇飲食大鼠的體重與正常組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),說明高膽固醇飼料喂養(yǎng)對(duì)大鼠體重?zé)o明顯影響。甘油三酯檢測(cè)結(jié)果顯示正常組為1.35±0.48mmol/L,而高膽固醇組為1.07±0.39mmol/L,辛伐他汀干預(yù)組TG平均值為1.15±0.28mmol/L,三組間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)�？偰懝檀紮z測(cè)結(jié)果顯示正常組為2.07±0.28mmol/L,而高膽固醇組為5.10±1.26mmol/L,辛伐他汀干預(yù)組TC平均值為3.33±1.15mmol/L,三組間比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001),高膽固醇組的總膽固醇高于其他組。低密度脂蛋白(LDL)平均值在正常組為0.44±0.11mmol/L,而高膽固醇組為2.09±0.75mmol/L,顯著升高(P0.001),5mg/kg辛伐他汀灌胃8周后LDL平均值為1.36±0.75 mmol/L,與高膽固醇組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。高密度脂蛋白(HDL)在正常組為1.21±0.17mmol/L,而高膽固醇組為1.10±0.34mmol/L,5mg/kg辛伐他汀灌胃8周后HDL平均值為1.01±0.24mmol/L,三組相比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);上述結(jié)果證實(shí)高脂血癥動(dòng)物模型成功建立。2.與正常飲食大鼠比較,高膽固醇飲食引起下頜骨組織炎癥反應(yīng)因子TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)水平升高,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而辛伐他汀干預(yù)后,qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β較高膽固醇飲食組下降,但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.骨組織形態(tài)計(jì)量結(jié)果顯示高膽固醇組大鼠下頜骨骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目分別為 19.03±8.62(%),26.36±7.46(μm),7.00±1.86(mm-1),與正常飲食組相比較明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,P0.05,P0.001),辛伐他汀干預(yù)組 BV/TV、Tb.Th、Tb.N 分別為 43.98±15.76(%),37.58±20.27(μm),12.89±4.32(mm-1),與高膽固醇飲食組相比較均明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,0.01,P0.001);高膽固醇飲食組 Tb.Sp 為 130.44±61.62(μm),較正常飲食組48.95±15.09(μm)顯著升高(P0.001),辛伐他汀干預(yù)后Tb.Sp為48.50±20.32(μm),與高膽固醇飲食組相比具有明顯差異性(P0.001);本結(jié)果證實(shí)高膽固醇飲食與下頜骨骨結(jié)構(gòu)負(fù)性相關(guān)。4.熒光定量PCR及免疫組化檢測(cè)大鼠下頜骨組織RANKL及OPG基因的mRNA及蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)高膽固醇飲食可以引起RANKL及OPG明顯升高(P0.001,P0.05),RANKL/OPG比值顯著升高(P0.05),而在辛伐他汀干預(yù)組,RANKL基因表達(dá)較高膽固醇飲食組明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),OPG表達(dá)較高膽固醇飲食組下降,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無明顯差異性,RANKL/OPG的比值較高膽固醇飲食組顯著下降(P0.001);本結(jié)果說明高膽固醇飲食可能引起破骨細(xì)胞活性增加,破壞頜骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡。5.熒光定量PCR及免疫組化檢測(cè)大鼠下頜骨組織NF-κB的mRNA及蛋白表達(dá),顯示高膽固醇組NF-κB明顯升高,具有顯著差異性(P0.05,P0.01),而辛伐他汀干預(yù)后,NF-κB基因表達(dá)明顯下降,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有差異性(P0.05,P0.05);說明NF-κB信號(hào)通路可能參與調(diào)控高脂血癥對(duì)下頜骨骨密度的破壞。6.與正常組比較,在高膽固醇飲食組大鼠頜骨組織中LC3及p62 mRNA表達(dá)水平明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有顯著差異性(P0.01,P0.05);與正常組比較,高膽固醇組LC3及p62蛋白表達(dá)明顯升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有顯著性差異(P0.05)。在辛伐他汀干預(yù)后,p62 mRNA表達(dá)明顯下降,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有顯著性差異(P0.01),而LC3 mRNA表達(dá)水平降低,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無明顯差異;利用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化進(jìn)行分析,顯示與高膽固醇飲食組比較,辛伐他汀藥物干預(yù)后p62蛋白表達(dá)下降明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有顯著性差異(P0.001),而LC3蛋白表達(dá)降低,無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;本結(jié)果說明自噬參與高膽固醇喂養(yǎng)大鼠下頜骨骨組織的改變,初步闡明自噬參與調(diào)控高膽固醇血癥大鼠下頜骨的代謝異常。結(jié)論:高膽固醇飲食喂養(yǎng)大鼠能夠穩(wěn)定建立高脂血癥動(dòng)物模型;高膽固醇飲食可以導(dǎo)致SD大鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)破壞,骨靜態(tài)參數(shù)下降,RANKL/OPG比值下調(diào),骨量下降。辛伐他汀藥物可以通過抑制NF-κB信號(hào),改善下頜骨微結(jié)構(gòu)。在NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)下,自噬可能參與調(diào)控高脂血癥大鼠頜骨微結(jié)構(gòu)的改變。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

圖１：?ＳＤ大鼠每周的體重。ＮＣ：正常組ＨＣ：高膽固醇組??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ｔｈｅ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ＳＤ?ｒａｔｓ?ｅｖｅｒｙ?ｗｅｅｋ．?ＮＣ：?ｎｏｒｍａｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；?ＨＣ：?ｈｉｇｈ??ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ．??７１??

圖２．生化檢測(cè)指標(biāo)：在３２周測(cè)量血清甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、密度脂蛋白。ＮＣ：正常飲食組；ＨＣ：高膽固醇飲食組；ＨＣ＋ＳＩＭ組：５ｍｇ／ｋｇ辛伐他汀＋高膽固醇飲食組。＊?Ｐ?＜?０．０５；?＊＊尸＜?０．０１??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ｔｅｓｔ．?Ｓｅｒｕｍ?ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ?（ＴＧ）．?ｔｏｔａｌ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?（ＴＣ），??ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ?ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ?（ＨＤＬ）?ａｎｄ?ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ?ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ?（ＬＤＬ）?ｌｅｖｅｌｓ?ｉｎ?ｒａｔｓ??ａｓｓａｙｅｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?３２ｔｈ?ｗｅｅｋ．?＂ＮＣ：?ｎｏｒｍａｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；?ＨＣ：?ｈｉｇｈ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；??ＨＣ＋ＳＩＭ：?ｈｉｇｈ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ＋ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ．?＊?尸?＜０．０５；?＊＊?尸＜?０．０１．??

圖３．下頜骨組織的ＨＥ染色。Ａ，Ｂ：正常飲食組下頜骨組織的ＨＥ染色（Ａ，?Ｘ４０：??Ｂ，?Ｘ１００）；?Ｃ，?Ｄ：高膽固醇飲食組下頜骨組織的ＨＥ染色（Ｃ，Ｘ４０；?Ｄ，?Ｘ１００）；??Ｅ，?Ｆ：?５ｍｇ／ｋｇ辛伐他�。吣懝檀硷嬍辰M下頜骨組織的ＨＥ染色（Ｅ，?Ｘ４０；?Ｆ，??Ｘ１００）。ＮＣ：正常飲食組；ＨＣ：高膽固醇飲食組；ＨＣ＋ＳＩＭ組：５ｍｇ／ｋｇ辛伐他??�。吣懝檀硷嬍辰M。??Ｆｉｇｕｒｅ?３．?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｊａｗ?ｂｏｎｅ?ｔｉｓｓｕｅ．?Ａ，?Ｂ：?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｉｎ?ＮＣ?ｇｒｏｕｐ?（Ａ，?Ｘ４０；??７３??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2863902