目的:高脂血癥又稱脂質(zhì)代謝異�；蛭蓙y,可分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、混合型高脂血癥,是糖尿病、動脈粥樣硬化、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥等疾病的主要誘發(fā)因素之一,臨床發(fā)病率高,嚴重危害人們的身體健康。作為高脂血癥相關(guān)的骨代謝性疾病,骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少,骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨骼疾病,常引起骨的脆性增加,容易發(fā)生骨折。口腔骨是全身骨骼的一部分,骨密度減低可能導致頜骨結(jié)構(gòu)減弱,影響義齒修復的效果,不利于種植體的骨整合�？谇还莵G失與骨質(zhì)疏松癥具有一定的相關(guān)性,是近年來學者研究的熱點之一。眾多研究認為在頜骨組織中高脂血癥與骨密度呈反向相關(guān),低骨密度將影響種植牙的骨整合、初期穩(wěn)定性及功能。然而,有學者發(fā)現(xiàn)含有甘油三脂的高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠不會導致骨量丟失,反而有利于骨的功能結(jié)構(gòu)。因此,研究高脂飲食對頜骨代謝的影響及機制具有重要臨床意義。細胞自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡,是一種廣泛存在于真核細胞、且進化上高度保守的細胞降解過程。早在40年前就由Christian deDuve提出這一概念,但是真正在分子水平上闡明自噬的調(diào)節(jié)及機制的研究,都是在酵母中突破并完成的。到目前為止,已在酵母遺傳篩選中鑒定了 32個不同的自噬相關(guān)基因(ATG)。ATG與細胞凋亡、衰老一樣,參與機體各階段的生長發(fā)育。近年來發(fā)現(xiàn)自噬在不同的成骨細胞、破骨細胞、骨細胞中均發(fā)揮著重要作用。自噬活性失調(diào)可能涉及骨骼相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)自噬與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系密切,自噬相關(guān)基因的變異可能影響骨的形成及重建,導致骨密度下降,骨質(zhì)疏松,易發(fā)生骨折。NF-κB做為轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員之一,常以同源二聚體形式存在于大部分細胞內(nèi),參與免疫反應(yīng)的早期階段和炎癥反應(yīng)的各個階段,影響細胞分化、凋亡、組織損傷及應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路參與自噬活性的調(diào)控,自噬相關(guān)基因Beclin 1及ATG5的激活可導致NF-κB信號兩個重要的調(diào)控因子IKK及NIK降解,而自噬抑制劑3-MA能夠阻斷這一過程。然而自噬是否影響高脂血癥的頜骨骨結(jié)構(gòu),NF-κB信號通路是否參與其中,目前尚未見文獻報道。本研究主要從以下三個部分進行。第一部分:高脂血癥動物模型建立,通過長時間喂養(yǎng)SD大鼠高膽固醇飲食,模擬現(xiàn)代人的高脂飲食習慣,建立高脂血癥動物模型;第二部分:高膽固醇飲食對大鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)的影響。在此動物模型基礎(chǔ)上,利用qPCR、免疫組化、骨組織形態(tài)計量等方法,證實高膽固醇飲食對大鼠下頜骨結(jié)構(gòu)的影響,探討NF-κB信號通路參與調(diào)控高膽固醇飲食對下頜骨結(jié)構(gòu)的改變以及辛伐他汀的治療意義;第三部分:自噬參與高膽固醇飲食大鼠下頜骨結(jié)構(gòu)改變的研究。利用qPCR、免疫組化等方法,研究在高膽固醇飲食及辛伐他汀藥物干預情況下,自噬相關(guān)基因LC3、p62在大鼠下頜骨組織中的表達,分析自噬是否參與調(diào)控高膽固醇飲食對頜骨結(jié)構(gòu)的改變,以期為高脂血癥患者頜骨骨量丟失及代謝異常的治療提供一個重要靶點,從而提高口腔種植及義齒修復的成功率,更好的滿足患者對高品質(zhì)生活的需求。方法:1.將30只SD大鼠隨機分為三組,正常飲食組(NC)、高膽固醇飲食組(HC)、5mg/kg辛伐他汀+高膽固醇飲食組(HC+SIM)。每周測量體重,喂養(yǎng)32周后取空腹12小時的靜脈血進行生化檢測血清甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指標,建立高脂血癥動物模型。2.利用實時熒光定量PCR技術(shù)方法檢測NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達,分析炎癥在高膽固醇飲食大鼠中的意義。3.將大鼠下頜骨組織固定、脫鈣,HE染色,利用Image Pro Plus 6.0軟件進行下頜骨骨組織形態(tài)計量,檢測靜態(tài)參數(shù):骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)進行統(tǒng)計學分析,明確高膽固醇飲食及辛伐他汀干預對大鼠頜骨微結(jié)構(gòu)的影響。4.運用實時熒光定量PCR及免疫組化技術(shù),分別檢測NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織中RANKL、OPG基因的mRNA及蛋白表達水平,分析RANKL、OPG、RANKL/OPG在高膽固醇飲食大鼠頜骨組織中的變化及辛伐他汀的干預意義。5.運用qPCR及免疫組化技術(shù),分別檢測NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織中炎癥信號NF-1κB的mRNA及蛋白表達水平,分析NF-κB信號是否參與調(diào)控高膽固醇飲食大鼠頜骨結(jié)構(gòu)的改變。6.運用qPCR及免疫組化技術(shù),分別檢測NC、HC、HC+SIM組的下頜骨組織中自噬相關(guān)基因LC3及p62的mRNA及蛋白表達水平,證實自噬是否參與高膽固醇飲食大鼠頜骨結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:1.高膽固醇飲食大鼠的體重與正常組無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),說明高膽固醇飼料喂養(yǎng)對大鼠體重無明顯影響。甘油三酯檢測結(jié)果顯示正常組為1.35±0.48mmol/L,而高膽固醇組為1.07±0.39mmol/L,辛伐他汀干預組TG平均值為1.15±0.28mmol/L,三組間比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)�？偰懝檀紮z測結(jié)果顯示正常組為2.07±0.28mmol/L,而高膽固醇組為5.10±1.26mmol/L,辛伐他汀干預組TC平均值為3.33±1.15mmol/L,三組間比較具有顯著統(tǒng)計學差異(P0.001),高膽固醇組的總膽固醇高于其他組。低密度脂蛋白(LDL)平均值在正常組為0.44±0.11mmol/L,而高膽固醇組為2.09±0.75mmol/L,顯著升高(P0.001),5mg/kg辛伐他汀灌胃8周后LDL平均值為1.36±0.75 mmol/L,與高膽固醇組比較具有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。高密度脂蛋白(HDL)在正常組為1.21±0.17mmol/L,而高膽固醇組為1.10±0.34mmol/L,5mg/kg辛伐他汀灌胃8周后HDL平均值為1.01±0.24mmol/L,三組相比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05);上述結(jié)果證實高脂血癥動物模型成功建立。2.與正常飲食大鼠比較,高膽固醇飲食引起下頜骨組織炎癥反應(yīng)因子TNF-α、IL-1βmRNA表達水平升高,無統(tǒng)計學差異(P0.05),而辛伐他汀干預后,qPCR檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β較高膽固醇飲食組下降,但是無統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.骨組織形態(tài)計量結(jié)果顯示高膽固醇組大鼠下頜骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目分別為 19.03±8.62(%),26.36±7.46(μm),7.00±1.86(mm-1),與正常飲食組相比較明顯下降,具有統(tǒng)計學差異(P0.001,P0.05,P0.001),辛伐他汀干預組 BV/TV、Tb.Th、Tb.N 分別為 43.98±15.76(%),37.58±20.27(μm),12.89±4.32(mm-1),與高膽固醇飲食組相比較均明顯升高,具有統(tǒng)計學差異(P0.001,0.01,P0.001);高膽固醇飲食組 Tb.Sp 為 130.44±61.62(μm),較正常飲食組48.95±15.09(μm)顯著升高(P0.001),辛伐他汀干預后Tb.Sp為48.50±20.32(μm),與高膽固醇飲食組相比具有明顯差異性(P0.001);本結(jié)果證實高膽固醇飲食與下頜骨骨結(jié)構(gòu)負性相關(guān)。4.熒光定量PCR及免疫組化檢測大鼠下頜骨組織RANKL及OPG基因的mRNA及蛋白表達,發(fā)現(xiàn)高膽固醇飲食可以引起RANKL及OPG明顯升高(P0.001,P0.05),RANKL/OPG比值顯著升高(P0.05),而在辛伐他汀干預組,RANKL基因表達較高膽固醇飲食組明顯降低,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),OPG表達較高膽固醇飲食組下降,但是統(tǒng)計學分析無明顯差異性,RANKL/OPG的比值較高膽固醇飲食組顯著下降(P0.001);本結(jié)果說明高膽固醇飲食可能引起破骨細胞活性增加,破壞頜骨代謝的動態(tài)平衡。5.熒光定量PCR及免疫組化檢測大鼠下頜骨組織NF-κB的mRNA及蛋白表達,顯示高膽固醇組NF-κB明顯升高,具有顯著差異性(P0.05,P0.01),而辛伐他汀干預后,NF-κB基因表達明顯下降,統(tǒng)計學檢驗具有差異性(P0.05,P0.05);說明NF-κB信號通路可能參與調(diào)控高脂血癥對下頜骨骨密度的破壞。6.與正常組比較,在高膽固醇飲食組大鼠頜骨組織中LC3及p62 mRNA表達水平明顯升高,統(tǒng)計學檢驗具有顯著差異性(P0.01,P0.05);與正常組比較,高膽固醇組LC3及p62蛋白表達明顯升高,統(tǒng)計學檢驗具有顯著性差異(P0.05)。在辛伐他汀干預后,p62 mRNA表達明顯下降,統(tǒng)計學檢驗具有顯著性差異(P0.01),而LC3 mRNA表達水平降低,但是統(tǒng)計學檢驗無明顯差異;利用Image Pro Plus 6.0軟件對免疫組化進行分析,顯示與高膽固醇飲食組比較,辛伐他汀藥物干預后p62蛋白表達下降明顯,統(tǒng)計學檢驗具有顯著性差異(P0.001),而LC3蛋白表達降低,無明顯統(tǒng)計學差異;本結(jié)果說明自噬參與高膽固醇喂養(yǎng)大鼠下頜骨骨組織的改變,初步闡明自噬參與調(diào)控高膽固醇血癥大鼠下頜骨的代謝異常。結(jié)論:高膽固醇飲食喂養(yǎng)大鼠能夠穩(wěn)定建立高脂血癥動物模型;高膽固醇飲食可以導致SD大鼠下頜骨微結(jié)構(gòu)破壞,骨靜態(tài)參數(shù)下降,RANKL/OPG比值下調(diào),骨量下降。辛伐他汀藥物可以通過抑制NF-κB信號,改善下頜骨微結(jié)構(gòu)。在NF-κB信號通路介導下,自噬可能參與調(diào)控高脂血癥大鼠頜骨微結(jié)構(gòu)的改變。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

圖１：?ＳＤ大鼠每周的體重。ＮＣ：正常組ＨＣ：高膽固醇組??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ｔｈｅ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ＳＤ?ｒａｔｓ?ｅｖｅｒｙ?ｗｅｅｋ．?ＮＣ：?ｎｏｒｍａｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；?ＨＣ：?ｈｉｇｈ??ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ．??７１??

圖２．生化檢測指標：在３２周測量血清甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、密度脂蛋白。ＮＣ：正常飲食組；ＨＣ：高膽固醇飲食組；ＨＣ＋ＳＩＭ組：５ｍｇ／ｋｇ辛伐他汀＋高膽固醇飲食組。＊?Ｐ?＜?０．０５；?＊＊尸＜?０．０１??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ｔｅｓｔ．?Ｓｅｒｕｍ?ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ?（ＴＧ）．?ｔｏｔａｌ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?（ＴＣ），??ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ?ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ?（ＨＤＬ）?ａｎｄ?ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ?ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ?（ＬＤＬ）?ｌｅｖｅｌｓ?ｉｎ?ｒａｔｓ??ａｓｓａｙｅｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?３２ｔｈ?ｗｅｅｋ．?＂ＮＣ：?ｎｏｒｍａｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；?ＨＣ：?ｈｉｇｈ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；??ＨＣ＋ＳＩＭ：?ｈｉｇｈ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ＋ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ．?＊?尸?＜０．０５；?＊＊?尸＜?０．０１．??

圖３．下頜骨組織的ＨＥ染色。Ａ，Ｂ：正常飲食組下頜骨組織的ＨＥ染色（Ａ，?Ｘ４０：??Ｂ，?Ｘ１００）；?Ｃ，?Ｄ：高膽固醇飲食組下頜骨組織的ＨＥ染色（Ｃ，Ｘ４０；?Ｄ，?Ｘ１００）；??Ｅ，?Ｆ：?５ｍｇ／ｋｇ辛伐他�。吣懝檀硷嬍辰M下頜骨組織的ＨＥ染色（Ｅ，?Ｘ４０；?Ｆ，??Ｘ１００）。ＮＣ：正常飲食組；ＨＣ：高膽固醇飲食組；ＨＣ＋ＳＩＭ組：５ｍｇ／ｋｇ辛伐他??汀＋高膽固醇飲食組。??Ｆｉｇｕｒｅ?３．?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｊａｗ?ｂｏｎｅ?ｔｉｓｓｕｅ．?Ａ，?Ｂ：?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｉｎ?ＮＣ?ｇｒｏｕｐ?（Ａ，?Ｘ４０；??７３??
【參考文獻】

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本文編號：2863902