目的檢測(cè)胰島素對(duì)肝細(xì)胞GABARAPL1表達(dá)的影響,并進(jìn)一步探討胰島素對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人永生化肝細(xì)胞(HL-7702),將細(xì)胞分為五組:A組(對(duì)照組)、B組(自噬激活組)、C組(胰島素組)、D組(胰島素阻斷組1)、E組(胰島素阻斷組2),處理方法如下:除A組外均加入100nM雷帕霉素處理6小時(shí),C、D、E組再分別加入1μM胰島素,其中D、E組需提前30分鐘分別加入LY294002(50μM)、Wortmannin(100nM),4小時(shí)之后細(xì)胞處理完成。通過(guò)提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品,利用Western Blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)基因GABARAPL1、LC3、Beclin1的表達(dá)情況,同時(shí)可借助透射電鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量的表達(dá)差異。隨后通過(guò)前期已成功構(gòu)建的胰島素調(diào)控識(shí)別模序失活突變體,及含有GABARAPL1啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),利用Luciferase Assay檢測(cè)熒光素酶活性,并比較其轉(zhuǎn)錄活性差異,尋找參與胰島素對(duì)GABARAPL1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的反應(yīng)元件,最后通過(guò)非放射性凝膠遷滯實(shí)驗(yàn)對(duì)該轉(zhuǎn)錄調(diào)控的結(jié)合位點(diǎn)予以確認(rèn)。結(jié)果1.Western Blotting結(jié)果示:相比于B組,C胰島素組可見(jiàn)GABRABPAL1、LC3、Beclin1表達(dá)減弱(P0.05);相比C組,D胰島素阻斷組可見(jiàn)GABRABPAL1、LC3、Beclin1表達(dá)增強(qiáng)(P0.01)。2.透射電鏡下觀察自噬小體的變化:相比于B、D、E組,C胰島素組自噬小體數(shù)目明顯減少。3.熒光素酶活性檢測(cè):失活GABARAPL1基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)IRE1反應(yīng)元件,其轉(zhuǎn)錄活性明顯下降(P0.01)。4.非放射性凝膠遷滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè):與其它陰性對(duì)照組相比,自噬激活組及胰島素阻斷組可見(jiàn)其核蛋白質(zhì)與標(biāo)記探針(biotin-FoxO1)形成的滯后結(jié)合帶,自噬激活組核蛋白質(zhì)與標(biāo)記探針及FoxO1抗體所形成的結(jié)合帶更為明顯且滯后,胰島素組內(nèi)其結(jié)合帶明顯減弱。結(jié)論1.胰島素抑制肝細(xì)胞GABARAPL1的基因表達(dá)。2.胰島素通過(guò)FoxO1與GABARAPL1基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)IRE1反應(yīng)元件的脫離,實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞GABARAPL1轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R587.1
【部分圖文】：

ARAPL1 啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，采取直接點(diǎn)突變聯(lián)合“序的方法，失活 GABARAPL1 啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的各個(gè)胰島素反應(yīng)元件，ferase Assay 檢測(cè)熒光素酶活性比較其轉(zhuǎn)錄活性差異，尋找其主要轉(zhuǎn)位點(diǎn)。圖 3.1 截除突變失活 GABARAPL1 基因啟動(dòng)子 IRE 反應(yīng)位點(diǎn)示意圖Gaparapl1SspI SphI BamHI-1715-1204-818+114IRE 11-15 IRE 7-10 IRE5-6IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1SspI SphI BamHI-818+114IRE 7-10 IRE5-6 IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1SphI BamHI-818+114IRE5-6 IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1BamHI+114IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1BamHI+114IRE 1-91GEC1GEC1-GED1GEC1-GED2GEC1-GED3GEC1-GED4

圖 4.2 透射電鏡下各組自噬小體數(shù)量注:A組:對(duì)照組,B組:自噬激活組,C組:胰島素組,D組:胰島素阻斷組1,E組胰島素阻斷組2,上圖均為放大 20000 倍透射電鏡下拍片,箭頭所指即為自噬小體.4.3 熒光素酶活性檢測(cè)及凝膠遷移電泳實(shí)驗(yàn)4.3.1 熒光素酶活性檢測(cè)報(bào)告本課題組前期已成功構(gòu)建胰島素調(diào)控識(shí)別模序失活突變體，及其含有GABARAPL1 啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，并通過(guò) Luciferase Assay 檢測(cè)熒光素酶活性比較其轉(zhuǎn)錄活性差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：接受胰島素信號(hào)調(diào)控的結(jié)構(gòu)域主要位于 GABARAPL1 基因啟動(dòng)子的 GEC1-D3 片段內(nèi)，并且在該片段內(nèi)，失活I(lǐng)RE1 反應(yīng)位點(diǎn)，其轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖 4.5 GABARAPL1 基因啟動(dòng)子 IRE1 與轉(zhuǎn)錄因子 FoxO1 結(jié)合反應(yīng)的 EMSA自噬激活組核蛋白質(zhì)+Probe,B 組:胰島素組核蛋白質(zhì)+Probe,C 組:胰島素阻斷+Probe,D 組:自噬激活組核蛋白質(zhì)+Probe+FoxO1 抗體,E 組:自噬激活組核蛋白normal lgG,F 組:自噬激活組核蛋白質(zhì)+Probe+過(guò)量冷探針,G 組:陰性對(duì)照,只加針.
【參考文獻(xiàn)】

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1 劉樂(lè)萍;胰島素對(duì)自噬相關(guān)基因GABARAPL1表達(dá)的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的初步研究[D];南華大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2861083