目的檢測胰島素對肝細胞GABARAPL1表達的影響,并進一步探討胰島素對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制。方法體外培養(yǎng)人永生化肝細胞(HL-7702),將細胞分為五組:A組(對照組)、B組(自噬激活組)、C組(胰島素組)、D組(胰島素阻斷組1)、E組(胰島素阻斷組2),處理方法如下:除A組外均加入100nM雷帕霉素處理6小時,C、D、E組再分別加入1μM胰島素,其中D、E組需提前30分鐘分別加入LY294002(50μM)、Wortmannin(100nM),4小時之后細胞處理完成。通過提取各組細胞蛋白質(zhì)樣品,利用Western Blotting法檢測自噬相關基因GABARAPL1、LC3、Beclin1的表達情況,同時可借助透射電鏡觀察各組細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量的表達差異。隨后通過前期已成功構(gòu)建的胰島素調(diào)控識別模序失活突變體,及含有GABARAPL1啟動子序列的熒光素酶報告系統(tǒng),利用Luciferase Assay檢測熒光素酶活性,并比較其轉(zhuǎn)錄活性差異,尋找參與胰島素對GABARAPL1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的反應元件,最后通過非放射性凝膠遷滯實驗對該轉(zhuǎn)錄調(diào)控的結(jié)合位點予以確認。結(jié)果1.Western Blotting結(jié)果示:相比于B組,C胰島素組可見GABRABPAL1、LC3、Beclin1表達減弱(P0.05);相比C組,D胰島素阻斷組可見GABRABPAL1、LC3、Beclin1表達增強(P0.01)。2.透射電鏡下觀察自噬小體的變化:相比于B、D、E組,C胰島素組自噬小體數(shù)目明顯減少。3.熒光素酶活性檢測:失活GABARAPL1基因啟動子區(qū)域內(nèi)IRE1反應元件,其轉(zhuǎn)錄活性明顯下降(P0.01)。4.非放射性凝膠遷滯實驗檢測:與其它陰性對照組相比,自噬激活組及胰島素阻斷組可見其核蛋白質(zhì)與標記探針(biotin-FoxO1)形成的滯后結(jié)合帶,自噬激活組核蛋白質(zhì)與標記探針及FoxO1抗體所形成的結(jié)合帶更為明顯且滯后,胰島素組內(nèi)其結(jié)合帶明顯減弱。結(jié)論1.胰島素抑制肝細胞GABARAPL1的基因表達。2.胰島素通過FoxO1與GABARAPL1基因啟動子區(qū)域內(nèi)IRE1反應元件的脫離,實現(xiàn)對肝細胞GABARAPL1轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。
【學位單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

ARAPL1 啟動子序列的熒光素酶報告系統(tǒng)，采取直接點突變聯(lián)合“序的方法，失活 GABARAPL1 啟動子區(qū)域內(nèi)的各個胰島素反應元件，ferase Assay 檢測熒光素酶活性比較其轉(zhuǎn)錄活性差異，尋找其主要轉(zhuǎn)位點。圖 3.1 截除突變失活 GABARAPL1 基因啟動子 IRE 反應位點示意圖Gaparapl1SspI SphI BamHI-1715-1204-818+114IRE 11-15 IRE 7-10 IRE5-6IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1SspI SphI BamHI-818+114IRE 7-10 IRE5-6 IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1SphI BamHI-818+114IRE5-6 IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1BamHI+114IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1BamHI+114IRE 1-91GEC1GEC1-GED1GEC1-GED2GEC1-GED3GEC1-GED4

圖 4.2 透射電鏡下各組自噬小體數(shù)量注:A組:對照組,B組:自噬激活組,C組:胰島素組,D組:胰島素阻斷組1,E組胰島素阻斷組2,上圖均為放大 20000 倍透射電鏡下拍片,箭頭所指即為自噬小體.4.3 熒光素酶活性檢測及凝膠遷移電泳實驗4.3.1 熒光素酶活性檢測報告本課題組前期已成功構(gòu)建胰島素調(diào)控識別模序失活突變體，及其含有GABARAPL1 啟動子序列的熒光素酶報告系統(tǒng)，并通過 Luciferase Assay 檢測熒光素酶活性比較其轉(zhuǎn)錄活性差異，實驗結(jié)果提示：接受胰島素信號調(diào)控的結(jié)構(gòu)域主要位于 GABARAPL1 基因啟動子的 GEC1-D3 片段內(nèi)，并且在該片段內(nèi)，失活IRE1 反應位點，其轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖 4.5 GABARAPL1 基因啟動子 IRE1 與轉(zhuǎn)錄因子 FoxO1 結(jié)合反應的 EMSA自噬激活組核蛋白質(zhì)+Probe,B 組:胰島素組核蛋白質(zhì)+Probe,C 組:胰島素阻斷+Probe,D 組:自噬激活組核蛋白質(zhì)+Probe+FoxO1 抗體,E 組:自噬激活組核蛋白normal lgG,F 組:自噬激活組核蛋白質(zhì)+Probe+過量冷探針,G 組:陰性對照,只加針.
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 韓秋月;陳公琰;;糖尿病與惡性腫瘤的關系[J];實用癌癥雜志;2013年01期

2 陳冬蓮;侯華新;鄭華;梁燕;黎丹戎;;大黃素對鼻咽癌CNE-1細胞放射增敏作用與細胞自噬關系的研究[J];中國藥理學通報;2012年11期

相關碩士學位論文 前1條

1 劉樂萍;胰島素對自噬相關基因GABARAPL1表達的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的初步研究[D];南華大學;2014年

本文編號：2861083