苯丙酮尿癥(Phenylketonuria,PKU)是一類由于體內(nèi)苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)代謝異常而導(dǎo)致的疾病,呈常染色體隱性遺傳。PKU在世界范圍內(nèi)分布廣泛、發(fā)病率高,會(huì)嚴(yán)重影響患者的認(rèn)知和心理。目前PKU患者主要通過飲食療法控制病情,這種方式不僅降低了患者的生活質(zhì)量,也給社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,臨床上需要新的治療方法。部分PKU患者的病因來自苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase,PAH)的無義突變,這種突變類型在某些實(shí)驗(yàn)中可以被新型化合物PTC124矯正。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建相關(guān)載體,對(duì)轉(zhuǎn)染無義突變PAH基因的細(xì)胞進(jìn)行PTC124處理并檢測(cè)其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的變化,探索了PTC124對(duì)PAH無義突變類型_(Y356X)PAH和_(W326X)PAH在表達(dá)過程中的矯正效果,以期為PKU的治療提供新策略。1、構(gòu)建相關(guān)載體本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù),成功構(gòu)建6個(gè)真核表達(dá)載體。一類是帶有紅熒光標(biāo)記的pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-_(Y356X)PAH和pCMV-DsRed-_(W326X)PAH,另一類是帶有G418標(biāo)記的pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH。2、體外表達(dá)系統(tǒng)的確定通過查閱文獻(xiàn)選擇HEK293細(xì)胞實(shí)現(xiàn)載體基因的表達(dá)。購(gòu)買細(xì)胞株后通過常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)培,并對(duì)其mRNA進(jìn)行初步分析,未檢測(cè)出PAH基因的表達(dá),證明HEK293細(xì)胞符合實(shí)驗(yàn)要求。3、載體的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將載體基因分別導(dǎo)入HEK293細(xì)胞。對(duì)轉(zhuǎn)染了pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-_(Y356X)PAH和pCMV-DsRed-_(W326X)PAH的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),轉(zhuǎn)染效率達(dá)到72%。對(duì)轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH的細(xì)胞進(jìn)行G418篩選,存活細(xì)胞即為陽性細(xì)胞。4、PTC124濃度的確定分別用濃度為0μM、50μM、100μM和200μM的PTC124處理HEK293細(xì)胞,再對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖分析。發(fā)現(xiàn)濃度為50μM和100μM的PTC124對(duì)細(xì)胞是相對(duì)安全的,濃度為200μM的PTC124對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖都有消極影響,還會(huì)將細(xì)胞阻滯在S期,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。最后選擇100μM為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中PTC124的處理濃度。5、各實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)使用載體pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-_(Y356X)PAH、pCMV-DsRed-_(W326X)PAH、pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH分別對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,然后將其分成兩部分:對(duì)照組是轉(zhuǎn)染PAH基因的細(xì)胞,進(jìn)行正常的細(xì)胞培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組是轉(zhuǎn)染了無義突變PAH基因的細(xì)胞,一部分進(jìn)行普通培養(yǎng),另一部分用濃度為100μM的PTC124處理。48h后分別對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行qPCR和Western Blot檢測(cè)。qPCR實(shí)驗(yàn)表明,各實(shí)驗(yàn)組均表達(dá)了PAH。PAH無義突變基因的表達(dá)量經(jīng)矯正培養(yǎng)后明顯高于普通培養(yǎng),但仍低于轉(zhuǎn)染PAH基因的表達(dá)量。Western Blot實(shí)驗(yàn)表明,各實(shí)驗(yàn)組都成功表達(dá)了PAH蛋白。經(jīng)矯正培養(yǎng)后無義突變實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的PAH增多。利用酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型和無義突變PAH的活性。分別利用pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染了PAH基因的細(xì)胞正常培養(yǎng),作為陽性參照。轉(zhuǎn)染了PAH無義突變基因的細(xì)胞分別經(jīng)過普通培養(yǎng)和矯正培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染野生型PAH基因的細(xì)胞合成了有活性的PAH;轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH的細(xì)胞中,經(jīng)過普通培養(yǎng)的未檢測(cè)到活性PAH,經(jīng)過PTC124矯正后細(xì)胞合成了有活性的PAH;與轉(zhuǎn)染野生型PAH基因的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染載體pcDNA3.1-_(Y356X)PAH的活性達(dá)到了19%,轉(zhuǎn)染載體pcDNA3.1-_(W326X)PAH的活性達(dá)到了13%。綜上所述,PTC124在PAH突變基因_(Y356X)PAH和_(W326)XPAH的表達(dá)過程中可以發(fā)揮矯正作用,使之能夠合成有活性的PAH蛋白。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R596.1
【部分圖文】：

因中存在大量已知突變，因此可以通過使用先進(jìn)的分子遺傳這種診斷的確認(rèn)[39]。世界上分布最廣泛的遺傳類代謝疾病。這種病的患者由于代丙氨酸（Phe）大量代謝為酪氨酸，因此產(chǎn)生了一系列臨床癥丙氨酸（Phe）在體內(nèi)的代謝途徑主要有三種（如圖 1.1）：這是體內(nèi)的主要代謝途徑；一種是經(jīng)過脫氨基作用轉(zhuǎn)化為苯丙謝途徑；另一種是轉(zhuǎn)化為羥苯丙氨酸，代謝產(chǎn)生尿黑酸，再0]。PKU 患者由于體內(nèi)合成 PAH 的數(shù)量降低或活性不足，不能累了大量 PAH，此時(shí)代謝旁路增強(qiáng)，Phe 被催化成苯丙酮酸。酮酸和血苯丙氨酸會(huì)抑制髓磷脂的合成，造成大腦白質(zhì)異常

圖 1.2 理論上可用于身體不同部位的治療方案[93]。g. 1.2 Therapeutic regimen can be used theoretically on different parts of the bo可能應(yīng)用于身體各部位的治療方法。BBB 適用于 LNAA 療法，NAA 跨越 BBB 的競(jìng)爭(zhēng)抑制。肝臟適用于基因治療，定點(diǎn)整合野生在肝臟中引入野生型 PAH 基因；BH4療法，增加一些患者的 PA助錯(cuò)誤折疊的 PAH 折疊成有活性的 PAH。大腦適用于所有的治療療法，采用靜脈注射 PAL。消化道適用于酶替代療法，口服活性少進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的 Phe。肌肉適用于基因治療，結(jié)合野生型 PAH 5 個(gè)完整基因，改變基因治療靶點(diǎn)。s 的治療方法也是一種對(duì) PKU 十分有效的治療方法。LNAA 可以白結(jié)合實(shí)現(xiàn)跨越過程。而在體內(nèi)環(huán)境中，LAT1 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì) LN

PTC124 對(duì) PAH 無義突變蛋白體外表達(dá)的矯正作用 多磊（Easobio）；一抗 PAH（Abcam）；二抗 Goat pAb to Rbbit泳緩沖液 10×（康為世紀(jì)）；G418（全式金）。建因 PAH、Y356XPAH 和W326XPAH 的表達(dá)載體的構(gòu)建庫(kù)中檢索人的 PAH 基因序列，找到其 CDs 區(qū)域的堿基序列
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 潘敏;;EVER2基因中的1個(gè)純合無義突變導(dǎo)致疣狀表皮發(fā)育不良[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(皮膚病學(xué)分冊(cè));2005年10期

2 謝驍祥;江高峰;杜柳濤;;基因治療藥物無義突變通讀活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];藥物分析雜志;2016年10期

3 申泉;柴寶峰;;抗早發(fā)性無義突變疾病藥物研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥物與臨床;2013年10期

4 徐湘民，廖燦，劉忠英，李堅(jiān)，彭朝暉，邱洛琳，張基增;一種新的β－地中海貧血基因──密碼子37無義突變[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;1996年04期

5 任兆瑞;;無義突變引起人類β°地中海貧血[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1980年03期

6 王雪峰 ,D.T.Fleischer,W.T.Whitehead,R.A.Wetsel,G.Peter,D.L.Haviland;一例人C5缺陷癥:β鏈第一密碼子無義突變[J];免疫學(xué)雜志;1993年03期

7 謝驍祥;袁輝;王震宇;程靜;吳磊;杜柳濤;江高峰;;無義突變型熒光素酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立[J];藥物分析雜志;2017年04期

8 聶欣;楊林花;柴寶峰;申泉;張媛;張耀方;陳劍芳;;凝血因子Ⅸ無義突變真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在COS-7細(xì)胞的表達(dá)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2010年03期

9 Van Engelen B.G.M.,Muchir A. ,Hutchison C.J. ,張玉龍;純合子核纖層蛋白A/C基因無義突變的致死表型[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(神經(jīng)病學(xué)分冊(cè));2005年06期

10 王瑩;應(yīng)文靜;孫金嶠;劉丹如;俞曄珩;王靜漪;王曉川;;中國(guó)X連鎖無丙種球蛋白血癥40例基因型表型相關(guān)性分析[J];中國(guó)循證兒科雜志;2012年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 歐陽平;NKX2.5新突變的鑒定、功能分析及其無義突變的通讀研究[D];華中科技大學(xué);2011年

2 魏中華;XPF無義突變與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性研究[D];上海交通大學(xué);2013年

3 陳劍芳;四種新的基因突變導(dǎo)致血友病B分子發(fā)病機(jī)制研究及通讀療法對(duì)無義突變所致血友病治療的初步研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

4 洪楠;Nance-Horan綜合征家系致病基因突變定位及功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

5 叢培寬;全基因組外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)X連鎖顯性遺傳性高度近視疾病的致病基因及人類基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)LOVD的創(chuàng)建[D];浙江大學(xué);2014年

6 王剛;F9基因無義突變導(dǎo)致重型血友病的分子機(jī)制[D];山西大學(xué);2013年

7 姚艷;氨基糖甙類藥物對(duì)無義突變的HERG通道的藥物拯救研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

8 馬蕾;特應(yīng)性皮炎與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及絲聚合蛋白的相關(guān)性研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 多磊;PTC124對(duì)PAH無義突變蛋白體外表達(dá)的矯正作用[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2019年

2 周晶晶;恢復(fù)無義突變及抑制失活p53活性的策略[D];湖北工業(yè)大學(xué);2018年

3 劉靜;無義突變RB1和MEN1抑癌基因的翻譯調(diào)控及通讀研究[D];山西大學(xué);2015年

4 秘迎君;去泛素化酶USP26基因的2個(gè)無義突變及6個(gè)錯(cuò)義突變對(duì)其酶活性的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

5 胡翠;5例X性聯(lián)無丙種球蛋白血癥的臨床表現(xiàn)及基因分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

6 陳濱;Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的基因突變分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2008年

7 李曉;基于TILLING的小麥淀粉合成關(guān)鍵基因突變體發(fā)掘與表達(dá)分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

8 謝小超;一例急性間歇性卟啉病的家系調(diào)查及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

9 曹靜;血小板無力癥基因突變的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2010年

10 袁丞達(dá);三例結(jié)節(jié)性硬化癥的基因突變分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2860578