[目的]1.建立制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSC)的方法,分離、擴(kuò)增、鑒定hUCMSC,為臨床提供材料。2.建立hUCMSC治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的臨床技術(shù)方案,實(shí)施10例SLE患者h(yuǎn)UCMSC的臨床治療,為hUCMSC治療SLE提供示范性技術(shù)方法和理論基礎(chǔ)。[方法]1.hUCMSC的制備取足月健康新生兒臍帶,將其分解為1mm3組織塊并采用反復(fù)3次貼壁法分離、擴(kuò)增hUCMSC,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hUCMSC細(xì)胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34和CD45的陽(yáng)性表達(dá)率,hUCMSC成脂、成骨和成軟骨定向誘導(dǎo)分化分析其分化潛能。2.hUCMSC治療經(jīng)省衛(wèi)計(jì)委立項(xiàng)批準(zhǔn),選擇解放軍昆明總醫(yī)院腎臟風(fēng)濕免疫科滿足納入標(biāo)準(zhǔn)的20例SLE患者作為受試者參與實(shí)驗(yàn),簽訂知情同意書(shū),隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組,每組各10名。對(duì)照組于d1采血作為治療前樣本并靜脈輸注甲潑尼龍15 mg/(kg· d),d4改為口服潑尼松片1 mg/(kg· d),2周后間隔2周減量10%,同時(shí)每4周1次靜脈輸注環(huán)磷酰胺(CTX)1 g/次,共5次;治療組在d6時(shí)開(kāi)始靜脈輸注hUCMSC 1×106個(gè)/Kg,1次/周,連續(xù)3次。3.hUCMSC的療效評(píng)價(jià)于hUCMSC治療結(jié)束后第2周、4周、8周、12周、24周時(shí)觀察、分析患者的臨床癥狀、狼瘡活動(dòng)度及血尿常規(guī)、生化指標(biāo)和免疫學(xué)指標(biāo);采用蛋白芯片對(duì)hUCMSC治療前后血清蛋白因子進(jìn)行分析,并對(duì)有顯著差異的特征性細(xì)胞因子進(jìn)一步行ELISA檢測(cè)驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)分析組間、組內(nèi)指標(biāo)差異。[結(jié)果]1.hUCMSC的制備組織塊直接貼壁法培養(yǎng)hUCMSC 7天后可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊爬出,三次組織貼壁培養(yǎng)細(xì)胞呈成纖維樣且具有典型的渦旋式生長(zhǎng)特征;第三代hUCMSC的CD73、CD90和C0105的表達(dá)率為98.7%、82.6%和80.1%,CD34和CD45表達(dá)率分別為0.17%和0.92%;成脂誘導(dǎo)分化2周后,油紅O染色陽(yáng)性,成骨誘導(dǎo)分化3周后,茜素紅染色陽(yáng)性;成軟骨誘導(dǎo)4周后,阿新藍(lán)染色陽(yáng)性。2.hUCMSC 療效(1)臨床癥狀、體征及SLEDAI評(píng)分:全部病例在治療2周后兩組患者發(fā)熱消失、皮疹消退,治療4周后治療組和對(duì)照組疲倦、乏力等癥狀減輕率分別為80.0%(8例)和70.0%(7例),關(guān)節(jié)痛明顯減輕率分別為60.0%(6例)和70.0%(7例),完全或者部分緩解率分別為80%(8例)和70%(7例),組間無(wú)明顯差異(P0.05)。治療組的SLEDAI評(píng)分顯著低于治療前(P0.05)。(2)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化:①組間比較:治療組血清補(bǔ)體C3含量顯著高于對(duì)照組(P0.05),組間 WBC、RBC、PLT、Hb、U-PRO、BUN、Cr、TP、ALB、IgG、IgA、IgM、C4無(wú)顯著差異(P0.05)。②組內(nèi)比較:外周血RBC、Hb、TP、ALB含量均升高、Cr含量下降(P0.05),U-PRO、GFR、IgA、IgM無(wú)差異(P0.05);治療組IgG在治療后升高(P0.05)。③起效時(shí)間比較:治療組外周血ALB、Hb含量分別于治療2周、4周明顯升高,Cr于2周后下降(P0.05),對(duì)照組ALB、Hb分別于治療后4周、8周明顯升高,Cr于8周后下降(P0.05);兩組外周血TP和RBC含量均于治療后12周和24周明顯升高(P0.01和P0.05)。④免疫學(xué)指標(biāo):外周血CD3+CD4+陽(yáng)性率治療后下降,NK陽(yáng)性率治療后升高,與治療前相比分別從第4周、24周差異明顯(P0.05);抗ANA抗體和抗dsDNA抗體滴度治療后顯著下降(P0.05)。(3)治療組血清細(xì)胞因子分析:蛋白芯片分析顯示:ICAM-1(CD54)、TNF-RII、TIMP-2、TIMP-1、IGFBP-3、IGFBP-6、SCF-R(CD117)、BMP-5 均呈高表達(dá)狀態(tài);BLC(CXCL13)、IL-4、BMP-4、EGF、BDNF、β-NGF在治療后下降,而IL-12p70、AR升高。進(jìn)一步定量檢測(cè)BLC(CXCL13)、BDNF、BMP-4,結(jié)果與蛋白芯片一致,BLC(CXCL13)降低明顯(P0.05),BDNF和BMP-4均降低,但無(wú)顯著差異(P0.05)。[結(jié)論]1.采用多次組織塊反復(fù)直接貼壁培養(yǎng)法獲得形態(tài)、生長(zhǎng)特性、細(xì)胞表面表達(dá)標(biāo)志物和誘導(dǎo)分化功能符合hUCMSC標(biāo)準(zhǔn)。2.hUCMSC治療可顯著改善SLE患者的臨床癥狀及體征,降低SLEDAI評(píng)分和自身抗體滴度,使外周血中RBC、Hb、TP、ALB、IgG、補(bǔ)體C3、CD3+CD4+陽(yáng)性率明顯升高,NK陽(yáng)性率明顯降低,縮短IgG和補(bǔ)體C3、ALB和Hb含量上升時(shí)間。3.hUCMSC 治療使血清中 BLC(CXCL13)、IL-4、BDNF、BMP-4、EGF、β-NGF含量下降,IL-12p70、AR上升,表明hUCMSC治療可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)水平來(lái)抑制SLE患者的自身免疫反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R593.241
【部分圖文】：

圖２治療前有差異指標(biāo)比較圖??２．２．２技術(shù)路線??臨床癥狀、體征觀察??＾治療組１０例???丨?ｒ，ｒ巾卞｜?隨機(jī)?／血樣【ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、ＣＲＰ、Ｃ３、??｜?ＳＬＥ患者篩選??＾ｐ｜ｃ４、丨ｇＧ?ＡＬＢ、ＴＰ等檢測(cè)??——對(duì)照組１０例｜???Ｉ?，??｜?—８０°Ｃ?凍存?｜??Ｘ?＇?ｉ??細(xì)胞因子蛋?｜?ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、??白芯片夯析?ＢＭＰ－４定量檢測(cè)??｜??Ｉ??統(tǒng)計(jì)分析??．．

（１）?ｈＵＣＭＳＣ的形態(tài)特點(diǎn)：根據(jù)ｈＵＣＭＳＣ貼壁生長(zhǎng)的特性，通過(guò)組織塊??直接貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)千細(xì)胞，將１ｍｍ３左右大小的臍帶組織均勻種??植在培養(yǎng)瓶中，可觀察到５天后即有少量細(xì)胞爬出，呈短梭形（如圖３Ａ），?８天??后貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞逐漸增多，圍繞組織周圍并呈集落狀；１２天后可見(jiàn)大量細(xì)胞??呈旋渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞融合度為８０％時(shí)可進(jìn)行第一次換液傳代（如圖３Ｂ）。??ｈＵＣＭＳＣ傳代至第３到第５代時(shí)細(xì)胞均勻散落瓶底貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)均一，均呈??長(zhǎng)梭形、成纖維細(xì)胞樣、渦旋狀生長(zhǎng)特性（如圖３?Ｃ，Ｄ）。??ｍｍ??注：Ａ、原代培養(yǎng)５天后爬出的ｈＵＣＭＳＣ形態(tài)；Ｂ、原代培養(yǎng)１２天后的ｈＵＣＭＳＣ；?Ｃ、第３??代?ｈＵＣＭＳＣ；?Ｄ、第?５?代?ｈＵＣＭＳＣ??圖３?ｈＵＣＭＳＣ光學(xué)鏡下的生長(zhǎng)形態(tài)（Ａ、Ｂｘ４０；?Ｃ、ＤｘｌＯＯ）??（２）?ｈＵＣＭＳＣ細(xì)胞表型：第３代ｈＵＣＭＳＣ流式分析結(jié)果顯示（如圖４）：??匚０７３、００９０和００１０５的陽(yáng)性表達(dá)率分別為為９８．７０％、８２．６０％和８０．１０％，??００３４和＃埃矗檔難糶員澩锫史直鷂?埃?保罰ズ停埃?梗玻�。�?２９??

代?ｈＵＣＭＳＣ；?Ｄ、第?５?代?ｈＵＣＭＳＣ??圖３?ｈＵＣＭＳＣ光學(xué)鏡下的生長(zhǎng)形態(tài)（Ａ、Ｂｘ４０；?Ｃ、ＤｘｌＯＯ）??（２）?ｈＵＣＭＳＣ細(xì)胞表型：第３代ｈＵＣＭＳＣ流式分析結(jié)果顯示（如圖４）：??匚０７３、００９０和００１０５的陽(yáng)性表達(dá)率分別為為９８．７０％、８２．６０％和８０．１０％，??００３４和＃埃矗檔難糶員澩锫史直鷂?埃?保罰ズ停埃?梗玻ァ＃崳?２９??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2860520