[目的]1.建立制備人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSC)的方法,分離、擴增、鑒定hUCMSC,為臨床提供材料。2.建立hUCMSC治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的臨床技術(shù)方案,實施10例SLE患者hUCMSC的臨床治療,為hUCMSC治療SLE提供示范性技術(shù)方法和理論基礎(chǔ)。[方法]1.hUCMSC的制備取足月健康新生兒臍帶,將其分解為1mm3組織塊并采用反復(fù)3次貼壁法分離、擴增hUCMSC,倒置相差顯微鏡觀察細胞生長特性,流式細胞術(shù)檢測hUCMSC細胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34和CD45的陽性表達率,hUCMSC成脂、成骨和成軟骨定向誘導分化分析其分化潛能。2.hUCMSC治療經(jīng)省衛(wèi)計委立項批準,選擇解放軍昆明總醫(yī)院腎臟風濕免疫科滿足納入標準的20例SLE患者作為受試者參與實驗,簽訂知情同意書,隨機分為治療組和對照組,每組各10名。對照組于d1采血作為治療前樣本并靜脈輸注甲潑尼龍15 mg/(kg· d),d4改為口服潑尼松片1 mg/(kg· d),2周后間隔2周減量10%,同時每4周1次靜脈輸注環(huán)磷酰胺(CTX)1 g/次,共5次;治療組在d6時開始靜脈輸注hUCMSC 1×106個/Kg,1次/周,連續(xù)3次。3.hUCMSC的療效評價于hUCMSC治療結(jié)束后第2周、4周、8周、12周、24周時觀察、分析患者的臨床癥狀、狼瘡活動度及血尿常規(guī)、生化指標和免疫學指標;采用蛋白芯片對hUCMSC治療前后血清蛋白因子進行分析,并對有顯著差異的特征性細胞因子進一步行ELISA檢測驗證。統(tǒng)計分析組間、組內(nèi)指標差異。[結(jié)果]1.hUCMSC的制備組織塊直接貼壁法培養(yǎng)hUCMSC 7天后可見細胞從組織塊爬出,三次組織貼壁培養(yǎng)細胞呈成纖維樣且具有典型的渦旋式生長特征;第三代hUCMSC的CD73、CD90和C0105的表達率為98.7%、82.6%和80.1%,CD34和CD45表達率分別為0.17%和0.92%;成脂誘導分化2周后,油紅O染色陽性,成骨誘導分化3周后,茜素紅染色陽性;成軟骨誘導4周后,阿新藍染色陽性。2.hUCMSC 療效(1)臨床癥狀、體征及SLEDAI評分:全部病例在治療2周后兩組患者發(fā)熱消失、皮疹消退,治療4周后治療組和對照組疲倦、乏力等癥狀減輕率分別為80.0%(8例)和70.0%(7例),關(guān)節(jié)痛明顯減輕率分別為60.0%(6例)和70.0%(7例),完全或者部分緩解率分別為80%(8例)和70%(7例),組間無明顯差異(P0.05)。治療組的SLEDAI評分顯著低于治療前(P0.05)。(2)實驗室指標變化:①組間比較:治療組血清補體C3含量顯著高于對照組(P0.05),組間 WBC、RBC、PLT、Hb、U-PRO、BUN、Cr、TP、ALB、IgG、IgA、IgM、C4無顯著差異(P0.05)。②組內(nèi)比較:外周血RBC、Hb、TP、ALB含量均升高、Cr含量下降(P0.05),U-PRO、GFR、IgA、IgM無差異(P0.05);治療組IgG在治療后升高(P0.05)。③起效時間比較:治療組外周血ALB、Hb含量分別于治療2周、4周明顯升高,Cr于2周后下降(P0.05),對照組ALB、Hb分別于治療后4周、8周明顯升高,Cr于8周后下降(P0.05);兩組外周血TP和RBC含量均于治療后12周和24周明顯升高(P0.01和P0.05)。④免疫學指標:外周血CD3+CD4+陽性率治療后下降,NK陽性率治療后升高,與治療前相比分別從第4周、24周差異明顯(P0.05);抗ANA抗體和抗dsDNA抗體滴度治療后顯著下降(P0.05)。(3)治療組血清細胞因子分析:蛋白芯片分析顯示:ICAM-1(CD54)、TNF-RII、TIMP-2、TIMP-1、IGFBP-3、IGFBP-6、SCF-R(CD117)、BMP-5 均呈高表達狀態(tài);BLC(CXCL13)、IL-4、BMP-4、EGF、BDNF、β-NGF在治療后下降,而IL-12p70、AR升高。進一步定量檢測BLC(CXCL13)、BDNF、BMP-4,結(jié)果與蛋白芯片一致,BLC(CXCL13)降低明顯(P0.05),BDNF和BMP-4均降低,但無顯著差異(P0.05)。[結(jié)論]1.采用多次組織塊反復(fù)直接貼壁培養(yǎng)法獲得形態(tài)、生長特性、細胞表面表達標志物和誘導分化功能符合hUCMSC標準。2.hUCMSC治療可顯著改善SLE患者的臨床癥狀及體征,降低SLEDAI評分和自身抗體滴度,使外周血中RBC、Hb、TP、ALB、IgG、補體C3、CD3+CD4+陽性率明顯升高,NK陽性率明顯降低,縮短IgG和補體C3、ALB和Hb含量上升時間。3.hUCMSC 治療使血清中 BLC(CXCL13)、IL-4、BDNF、BMP-4、EGF、β-NGF含量下降,IL-12p70、AR上升,表明hUCMSC治療可能通過調(diào)節(jié)細胞因子表達水平來抑制SLE患者的自身免疫反應(yīng)。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R593.241
【部分圖文】：

圖２治療前有差異指標比較圖??２．２．２技術(shù)路線??臨床癥狀、體征觀察??＾治療組１０例???丨?ｒ，ｒ巾卞｜?隨機?／血樣【ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、ＣＲＰ、Ｃ３、??｜?ＳＬＥ患者篩選??＾ｐ｜ｃ４、丨ｇＧ?ＡＬＢ、ＴＰ等檢測??——對照組１０例｜???Ｉ?，??｜?—８０°Ｃ?凍存?｜??Ｘ?＇?ｉ??細胞因子蛋?｜?ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、??白芯片夯析?ＢＭＰ－４定量檢測??｜??Ｉ??統(tǒng)計分析??．．

（１）?ｈＵＣＭＳＣ的形態(tài)特點：根據(jù)ｈＵＣＭＳＣ貼壁生長的特性，通過組織塊??直接貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)千細胞，將１ｍｍ３左右大小的臍帶組織均勻種??植在培養(yǎng)瓶中，可觀察到５天后即有少量細胞爬出，呈短梭形（如圖３Ａ），?８天??后貼壁生長的細胞逐漸增多，圍繞組織周圍并呈集落狀；１２天后可見大量細胞??呈旋渦狀生長，細胞融合度為８０％時可進行第一次換液傳代（如圖３Ｂ）。??ｈＵＣＭＳＣ傳代至第３到第５代時細胞均勻散落瓶底貼壁生長，形態(tài)均一，均呈??長梭形、成纖維細胞樣、渦旋狀生長特性（如圖３?Ｃ，Ｄ）。??ｍｍ??注：Ａ、原代培養(yǎng)５天后爬出的ｈＵＣＭＳＣ形態(tài)；Ｂ、原代培養(yǎng)１２天后的ｈＵＣＭＳＣ；?Ｃ、第３??代?ｈＵＣＭＳＣ；?Ｄ、第?５?代?ｈＵＣＭＳＣ??圖３?ｈＵＣＭＳＣ光學鏡下的生長形態(tài)（Ａ、Ｂｘ４０；?Ｃ、ＤｘｌＯＯ）??（２）?ｈＵＣＭＳＣ細胞表型：第３代ｈＵＣＭＳＣ流式分析結(jié)果顯示（如圖４）：??匚０７３、００９０和００１０５的陽性表達率分別為為９８．７０％、８２．６０％和８０．１０％，??００３４和＃埃矗檔難糶員澩锫史直鷂?埃?保罰ズ停埃?梗玻�。�?２９??

代?ｈＵＣＭＳＣ；?Ｄ、第?５?代?ｈＵＣＭＳＣ??圖３?ｈＵＣＭＳＣ光學鏡下的生長形態(tài)（Ａ、Ｂｘ４０；?Ｃ、ＤｘｌＯＯ）??（２）?ｈＵＣＭＳＣ細胞表型：第３代ｈＵＣＭＳＣ流式分析結(jié)果顯示（如圖４）：??匚０７３、００９０和００１０５的陽性表達率分別為為９８．７０％、８２．６０％和８０．１０％，??００３４和＃埃矗檔難糶員澩锫史直鷂?埃?保罰ズ停埃?梗玻�。�?２９??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 徐志娟;盛立霞;歐陽桂芳;;臍帶血間充質(zhì)干細胞對外周血T淋巴細胞亞群的影響（英文）[J];中國實驗血液學雜志;2015年01期

2 楊桂鮮;潘麗萍;周巧艷;宋薇;陳志琴;汪成孝;吳艷波;王晞;陳強;;臍帶間充質(zhì)干細胞移植輔助治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效觀察[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2014年02期

3 ;Efficacy and safety of rituximab therapy for systemic lupus erythematosus:a systematic review and meta-analysis[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2012年09期

4 李慧;孫凌云;;MRL/lpr鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞作用的研究[J];中華風濕病學雜志;2007年06期

本文編號：2860520