目的動(dòng)態(tài)的骨重建過程維持了骨骼的大小、體積、形態(tài)和力學(xué)的完整性。在骨重建過程中,成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收動(dòng)態(tài)平衡,對于保持骨量和維持機(jī)體骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。年齡、激素水平、失重、細(xì)胞因子、血管、骨的微環(huán)境等多種因素均與骨重建密切相關(guān)。其中,骨的微環(huán)境變化在骨重建中的作用日益受到重視。業(yè)已證實(shí),骨組織局部細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞分泌的IL-1、IL-4、TGF-β等細(xì)胞因子,在骨重建中發(fā)揮重要作用。探討骨微環(huán)境變化對骨重建的影響和調(diào)控機(jī)理成為骨質(zhì)疏松研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn),對于發(fā)現(xiàn)潛在的治療骨質(zhì)疏松藥物靶標(biāo)十分重要。巨噬細(xì)胞是自身免疫系統(tǒng)中的重要組成部分,在宿主防御和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn),骨髓來源的巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM)參與調(diào)控骨的重構(gòu)過程,采用人工方式誘導(dǎo)BMDM凋亡,或者清除骨髓內(nèi)BMDM,可導(dǎo)致受損骨修復(fù)過程中骨鈣的沉積和礦化受到抑制,并抑制新骨的形成。然而,BMDM通過何種機(jī)理參與骨的重構(gòu)目前尚屬未知。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)受體激動(dòng)劑Exendin-4能夠提高成骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)骨形成,抑制破骨細(xì)胞骨吸收。文獻(xiàn)報(bào)道,巨噬細(xì)胞表達(dá)GLP-1受體,并且M2型巨噬細(xì)胞可以分泌很多促進(jìn)骨形成的因子,例如TGF-β、骨橋蛋白(osteopontin)、1,25-二羥基-維生素D3和BMP-2等。當(dāng)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSC)共培養(yǎng)時(shí),巨噬細(xì)胞分泌的因子能夠提高堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性和I型膠原(collagen I)的合成與分泌,從而促進(jìn)BMSC向成骨細(xì)胞分化,從而促進(jìn)骨形成。然而,M1巨噬細(xì)胞能夠分泌大量的促炎因子,例如TNF-α、IL-1、IL-6等,這些細(xì)胞因子抑制成骨細(xì)胞的分化,促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的生成,導(dǎo)致骨形成降低,骨吸收能力增強(qiáng),降低骨量。根據(jù)以上巨噬細(xì)胞對骨代謝的影響作用,我們提出假說:GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4是否可以通過與BMDM上GLP-1受體結(jié)合,調(diào)控炎性因子的分泌,進(jìn)而促進(jìn)骨形成,改善骨質(zhì)疏松。為了證明此假說,本課題擬在整體動(dòng)物水平、細(xì)胞水平和分子水平上研究Exendin-4對骨髓巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用,以及對骨形成的影響。方法1.小鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)和骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測選取3月齡C57BL/6雌鼠為實(shí)驗(yàn)對象,隨機(jī)分為對照組、卵巢切除(OVX)組、OVX+Exendin-4組共三組,每組8只小鼠。腹腔注射Exendin-4(5μg/kg/d),每周給藥6天,停1天,給藥12周。治療結(jié)束以前,先行小鼠進(jìn)行活體Micro-CT掃描,用于骨組織形態(tài)學(xué)分析,觀察骨小梁的結(jié)構(gòu)變化。然后,取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨,將樣品隨機(jī)分為3組,第一組骨組織樣品脫鈣處理后,骨組織切片、HE染色和TRAP染色,并采用免疫組化法檢測骨組織中CD29、Sca-1、TGF-β1、CD68等的表達(dá);第二組骨組織樣品不脫鈣,硬組織切片進(jìn)行鈣黃綠素和四環(huán)素雙熒光標(biāo)記,分析新骨形成情況;最后一組骨組織樣品冷凍于液氮中,用于分析骨形成蛋白Osterix和Runx-2的表達(dá)以及TGF-β1蛋白的表達(dá)。為了觀察BMDM對骨形成的影響,我們用氯膦酸脂質(zhì)體清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞后進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)檢測。選取3月齡C57BL/6雌鼠為實(shí)驗(yàn)對象,隨機(jī)分組為對照組、卵巢切除(OVX)組、OVX+Exendin-4組、OVX+氯膦酸脂質(zhì)體組、OVX+氯膦酸脂質(zhì)體+Exendin-4組,共五組,每組8只小鼠。腹腔注射氯膦酸脂質(zhì)體(混勻狀態(tài)下,氯膦酸鹽7 mg/ml,腹腔注射劑量為10μl/g),每3天給1次藥,給藥12周。治療結(jié)束以前,對小鼠進(jìn)行活體Micro-CT掃描,骨組織形態(tài)學(xué)分析,觀察骨小梁的結(jié)構(gòu)變化。治療結(jié)束后,取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨。將骨組織樣品脫鈣處理后,采用免疫組化檢測骨組織中CD68、TGF-β1的表達(dá)。2.骨髓巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及誘導(dǎo)分化(1)BMDM的分離、培養(yǎng)及鑒定選取6-8周C57BL/6雌鼠為實(shí)驗(yàn)對象,脫頸處死后取雙側(cè)股骨及脛骨,剪去兩端骨骺,用H-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,制成細(xì)胞懸液。離心,棄上清,加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)6 h后,吸取未貼壁細(xì)胞,離心,棄上清,加入含有10%FBS,終濃度為25 ng/ml的MCSF的H-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)吹打至均勻地細(xì)胞懸液,接種于24孔板中,每3 d換一次液,培養(yǎng)7 d,采用流式細(xì)胞儀,通過檢測細(xì)胞表面特異性抗原F4/80,CD11b進(jìn)行鑒定。(2)BMDM的誘導(dǎo)極化及鑒定分離培養(yǎng)的BMDM經(jīng)鑒定后,分別進(jìn)行M1極化和M2極化培養(yǎng)。24孔板中加入誘導(dǎo)極化培養(yǎng)基。M1誘導(dǎo)極化組加入含有10%FBS,LPS(100 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)的H-DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)3 d。M2誘導(dǎo)極化組加入含有10%FBS和IL-4(25 ng/ml)的H-DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)3 d。采用ELISA方法檢測極化后的BMDM培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1ra的含量;采用RT-PCR和Western blot檢測BMDM中的iNOS,Arg-1等基因和蛋白的表達(dá)。3.Exendin-4對BMDM極化的影響分離培養(yǎng)的BMDM經(jīng)鑒定后,隨機(jī)分為4組,分別為對照組、Exendin-4組、M1組和M2組。Exendin-4組加入含有10%FBS和Exendin-4(0.1 mmol/l)的H-DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)3 d,M1和M2組培養(yǎng)方法同上。采用ELISA方法檢測極化后的BMDM培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1ra的含量;采用RT-PCR和Western blot檢測BMDM中的iNOS,Arg-1等基因和蛋白的表達(dá)。4.Exendin-4作用于BMDM影響B(tài)MSC的遷移通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察Exendin-4是否通過作用于BMDM影響B(tài)MSC的遷移。BMDM為下室細(xì)胞,BMSC為上室細(xì)胞。BMDM接種在24孔板中,100μl,10~6/ml。給予不同處理,分為對照組、MФ、LPS+IFN-γ、LPS+IFN-γ+MФ、IL-4、IL-4+MФ、Exendin-4、Exendin-4+MФ、IL-10(10 ng/ml)、IL-10+MФ、IL-10+MФ+TGF-β1 Ab(0.5μg/ml)、Exendin-4+MФ+TGF-β1 Ab、TGF-β1(1 ng/ml)、TGF-β1+TGF-β1 Ab組。上室中加入BMSC的細(xì)胞懸液150μl,2×10~5/ml。37℃,5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛中固定30 min,PBS清洗3次,0.01%的結(jié)晶紫溶液中染色15 min,清洗,顯微鏡觀察,計(jì)數(shù)。5.Exendin-4對骨組織血管形成的影響(1)整體動(dòng)物水平檢測Exendin-4對骨組織血管形成的影響選取3月齡C57BL/6雌鼠,隨機(jī)分為對照組、卵巢切除(OVX)組、OVX+Exendin-4組共三組,每組8只。腹腔注射Exendin-4(5μg/kg/d),治療結(jié)束后,取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨。骨組織隨機(jī)分為兩組。第一組骨組織樣品脫鈣處理后,采用免疫組化檢測骨組織CD31的表達(dá)。第二組骨組織樣品液氮保存,RT-PCR和Western blot檢測血管形成相關(guān)蛋白VEGF、MMP-2和CD31基因和蛋白的表達(dá)情況。(2)細(xì)胞水平檢測Exendin-4對BMDM分泌促血管形成因子的影響B(tài)MDM隨機(jī)分為4組,分別為對照組、Exendin-4組、M1誘導(dǎo)組和M2誘導(dǎo)組。Exendin-4組加入含有10%FBS和Exendin-4(0.1 mmol/l)的H-DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)3d,M1誘導(dǎo)組和M2誘導(dǎo)組培養(yǎng)方法同上。采用RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞中血管形成相關(guān)蛋白VEGF和MMP-2的基因和蛋白的表達(dá)情況。6.Exendin-4調(diào)控BMDM極化相關(guān)信號分子的檢測BMDM培養(yǎng)液中加入Exendin-4,然后分別給予PKA抑制劑H-89、mTOR抑制劑Rapamycin和PI3K抑制劑wortmannin,Western blot檢測M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg-1的表達(dá),觀察Exendin-4通過哪條信號通路影響巨噬細(xì)胞極化。用Exendin-4處理細(xì)胞,Western blot檢測P-PKA,P-STAT3和TGF-β1的表達(dá)情況;Exendin-4處理BMDM的同時(shí),分別給予腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin、PKA抑制劑H-89和GLP-1R拮抗劑處理,Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)P-STAT3的表達(dá)水平,確證Exendin-4調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的信號通路。免疫共沉淀法檢測GLP-1受體信號通路與BMDM極化通路之間互調(diào)的作用方式。結(jié)果1.BMDM參與Exendin-4改善OVX小鼠骨質(zhì)疏松的作用OVX小鼠經(jīng)Exendin-4治療12周后,其股骨和脛骨的骨小梁數(shù)目和骨小梁厚度顯著增加,骨微結(jié)構(gòu)改善。HE染色結(jié)果顯示,骨表面成骨細(xì)胞的數(shù)量顯著增加,與成骨細(xì)胞活性相關(guān)的Runx-2和Osterix的表達(dá)也顯著增加。TRAP染色結(jié)果顯示,Exendin-4能夠抑制破骨細(xì)胞的活性。免疫組化檢測結(jié)果顯示,Exendin-4能顯著增加BMSC在骨表面的數(shù)量,提高TGF-β1在骨表面的表達(dá),并且Exendin-4也能增加骨組織內(nèi)TGF-β1蛋白的表達(dá)。免疫組化檢測結(jié)果顯示,OVX小鼠BMDM數(shù)量與對照組相比顯著增多,給予氯膦酸脂質(zhì)體處理后,小鼠骨髓內(nèi)巨噬細(xì)胞(BMDM)的數(shù)量顯著減少。清除小鼠BMDM后,Exendin-4促進(jìn)骨小梁數(shù)量增多的作用顯著減弱,同時(shí),骨組織內(nèi)TGF-β1的含量也明顯降低。上述結(jié)果提示,BMDM參與了Exendin-4介導(dǎo)的骨形成作用。2.Exendin-4促進(jìn)BMDM M2型極化,促進(jìn)其分泌TGF-β1,繼而誘導(dǎo)BMSC遷移檢測確證分離獲得的BMDM表達(dá)有GLP-1受體,Exendin-4處理BMDM后,其M2型細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1、CD206的表達(dá)顯著增加,M1型細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、TNF-α顯著減少。整體動(dòng)物檢測結(jié)果顯示,Exendin-4能顯著增加小鼠骨組織中巨噬細(xì)胞M2標(biāo)志物Arg-1的表達(dá),減少M(fèi)1標(biāo)志物iNOS的表達(dá),增加小鼠血清中M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物IL-1ra的含量,降低M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物TNF-α的含量。以上結(jié)果提示,Exendin-4能夠促進(jìn)BMDM極化為M2型。進(jìn)一步通過Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Exendin-4處理巨噬細(xì)胞后,能夠引發(fā)大量的BMSC遷移,Exendin-4促進(jìn)BMDM表達(dá)和釋放TGF-β1,預(yù)先給予TGF-β1抗體處理BMDM后,Exendin-4誘導(dǎo)BMSC遷移的作用顯著減弱。上述結(jié)果提示,Exendin-4通過促進(jìn)BMDM分泌TGF-β1,繼而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。3.Exendin-4激活BMDM中PKA-STAT3信號通路調(diào)控BMDM極化在培養(yǎng)的BMDM實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),預(yù)先給與PKA抑制劑H-89后,Exendin-4促進(jìn)Arg-1、P-STAT3和TGF-β1表達(dá)的作用顯著減弱。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),GLP-1受體拮抗劑Ex(9-39)顯著降低P-STAT3的表達(dá),腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Forsklin)能夠顯著提高P-STAT3的表達(dá)。免疫共沉淀結(jié)果顯示,Exendin-4促進(jìn)PKA蛋白和STAT3蛋白之間的相互作用。上述結(jié)果提示,Exendin-4通過激活cAMP/PKA/STAT3信號通路,進(jìn)而促進(jìn)STAT3磷酸化,繼而促進(jìn)BMDM向M2型極化,同時(shí)促進(jìn)TGF-β1的生成和分泌,促進(jìn)BMSC的遷移。4.Exendin-4促進(jìn)BMDM分泌VEGF、MMP-2,促進(jìn)血管形成。OVX小鼠經(jīng)Exendin-4治療12周后,其骨組織內(nèi)VEGF、MMP-2和CD31的表達(dá)顯著提高。免疫組化檢測結(jié)果顯示,Exendin-4能顯著增加CD31陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞在骨組織內(nèi)的數(shù)量。細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,Exendin-4能顯著提高BMDM產(chǎn)生VEGF和MMP-2。以上結(jié)果提示,Exendin-4可以通過促進(jìn)BMDM分泌血管形成因子,繼而促進(jìn)骨內(nèi)CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,促進(jìn)血管生成,進(jìn)而促進(jìn)骨形成。結(jié)論1.Exendin-4可以改善OVX小鼠骨質(zhì)疏松,該效應(yīng)與BMDM密切相關(guān)。2.Exendin-4可以誘導(dǎo)BMDM向M2型極化,促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1,并促進(jìn)BMSC向骨吸收表面轉(zhuǎn)移,提高骨表面成骨的細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)骨的形成。3.Exendin-4通過激動(dòng)BMDM表面的GLP-1受體,繼而激活cAMP/PKA/STAT3信號通路,促進(jìn)STAT3入核,誘導(dǎo)BMDM發(fā)生M2極化。4.Exendin-4誘導(dǎo)的M2型BMDM能夠分泌VEGF和MMP-2,VEGF和MMP-2則可能通過促進(jìn)骨組織內(nèi)血管形成,增加血流供應(yīng),最終促進(jìn)新骨形成。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文獻(xiàn)回顧
    一.骨質(zhì)疏松與骨重建
    二.GLP-1受體激動(dòng)劑與骨代謝
    三.骨髓巨噬細(xì)胞與骨代謝
第一部分 EXENDIN-4改善卵巢切除小鼠骨質(zhì)疏松作用依賴于骨髓巨噬細(xì)胞的存在
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第二部分 EXENDIN-4調(diào)控骨髓巨噬細(xì)胞向M2型極化
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第三部分 EXENDIN-4激活BMDM中PKA-STAT3信號通路促進(jìn)骨形成
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
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本文編號：2858128