研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種在黃種人群中高發(fā)的典型自身免疫性疾病之一,通常情況下,患者的免疫細胞異常活化,產生大量自身抗體與免疫復合物,各種細胞免疫應答功能紊亂,最終導致全身多器官系統(tǒng)受損。SLE的的癥狀多種多樣,主要累及皮膚黏膜、腎、血液系統(tǒng)、關節(jié)和神經等多種器官。以往的研究多偏向于SLE與遺傳,表觀遺傳等基因組學研究,然而目前研究結果揭示SLE的發(fā)生、發(fā)展、轉化與非編碼RNA(包括IncRNA和miRNA等)有顯著的相關性,環(huán)狀RNA也是非編碼RNA家族中的一員,雖然它早就被發(fā)現(xiàn),但是一直沒有被真正深入的研究,近年來,它因自身的一系列突出特點——如半衰期長、組織特異性明顯等成為近年來的明星分子,但是SLE與環(huán)狀RNA的關聯(lián)僅有寥寥數篇文章,且缺乏第三代測序技術(RNA-seq)在SLE患者與正常人PBMCs中的研究。目的借助RNA-seq技術了解環(huán)狀RNA在SLE患者與正常人PBMCs中的表達情況,初步篩選可能作為紅斑狼瘡生物標志物的分子,并進行驗證實驗。選其中數據最良好的一個(circ-PTPN22)初步探討其可能的作用機制。方法本課題采用病例對照設計,收集未經過治療的新發(fā)SLE患者4例,和3例健康對照,利用RNA-seq技術初步篩選出128種差異化表達的circRNA(log2FC≥1.0),選取其中2種上調circRNA(circ-LRRK2、circ-PPHLN1)和2種下調circRNA(circ-PTPN22、circ-MYBL1)做大樣本量RT-qPCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction)驗證(49例SLE患者與37例健康對照),再選取差異較為明顯的circRNA-circPTPN22做進一步分析(桑格測序,SLEDAI指數相關性,治療前后對比,ROC曲線等),并預測circPTPN22可能的生物學功能,如靶向miRNA結合功能,ORF框預測,IRES結合位點預測,可能翻譯的蛋白質序列預測等。隨即用分子生物學技術構建過表達circPTPN22的載體質粒,將質粒電穿孔轉染jurkat細胞,用免疫印跡試驗(western blot,WB)證實了其能夠翻譯蛋白質,并預測了circPTPN22及其翻譯的小蛋白可能的功能作用。結果本研究借助RNA-seq技術初步篩選出128個在SLE患者和健康對照組PBMCs中差異表達的環(huán)狀RNA(log2FC≥1.0),包括89種上調circRNA與39種下調circRNA,部分測出的circRNA未被circbase網站收錄。篩選出的4種circRNA(circ-LRRK2、circ-PPHLN1、circ-PTPN22、circ-MYBL1)的RT-qPCR趨勢均與RNA-seq結果相符。Circ-PTPN22進一步分析提示,circPTPN22與病人的SLEDAI指數呈明顯的負相關性,即病人的SLEDAI評分越高,circPTPN22的表達越低。在病人治療前后的對比中,治療后的病人circPTPN22的表達較治療前明顯上升。ROC曲線圖提示circPTPN22的曲線下面積(AUC)為0.918,提示circPTPN22具有較好的診斷價值。進一步生物學分析表明,circPTPN22可結合多種miRNA,這些miRNA的靶基因,如CD28,IL7等多與免疫調節(jié)相關。此外,circPTPN22還具有IRES位點以及多個ORF框,預測具有蛋白質翻譯活性。構建過表達circPTPN22載體,電轉染jurkat細胞,WB結果顯示,circPTPN22的確能翻譯出蛋白質。結論本次研究發(fā)現(xiàn)了128個在健康人與初發(fā)SLE患者PBMCs內差異表達的circRNA,證實了circPTPN22、circMYBL1在SLE患者體內表達較低,circ-LRRK2、circ-PPHLN1在SLE患者體內表達升高。證明了circPTPN22的確存在,并具有優(yōu)良的SLE病情判斷能力,有望成為新的SLE活動標志物。證實了circPTPN22確實可以翻譯蛋白質(circPTPN22-pro)。并進一步預測了circPTPN22和新蛋白circPTPN22-pro的功能作用。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R593.241
【部分圖文】：

28 SLE 患者和健康對組 circRNA 表達譜的鑒定形圖顯示了各個樣本歸 化（標準化）后近似相等的分布。點圖，可將 SLE 組與對照組 circRNA 的表達差異可視化。紅色和綠色圓

圖 2 SLE 患者與健康對照組間異常環(huán)狀 rna 的生物信息學分析。(A)128 個差異表達的 circRNA 來源的染色體的位置分布。(B)SLE 組與正常組之間環(huán)狀 rna-mirna-mrna 網絡的 KEGG 通路分析。y 軸代表最顯著富集的通路名稱，x 軸代表通路的得分(P 值的負對數)。上圖為上調的 circRNAs;下圖為下調的 circRNAs。Fig. 2. Computational bioinformatics analysis of aberrant circRNAs betweenpatients with SLE and healthy controls.(A) The differentially expressed circRNAs and the distributions of their chromosomallocations. (B) KEGG analysis of the circRNA-miRNA-mRNAs network between theSLE and normal groups. The y-axis represents the most significantly enriched pathways,and the x-axis represents their scores (negative logarithm of P value). Up, upregulatedcircRNAs; down, downregulated circRNAs.

圖 3 SLE 患者和正常人 PBMC 中各環(huán)狀 RNA 的表達情況(A) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對照組 pbmc 中 circLRRK2 的表達。(B) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對照組 pbmc 中 circPPHLN1 的表達。(C) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對照組 pbmc 中 circPTPN22 的表達。(D) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對照組 pbmc 中 circMYBL1 的表達。Fig.3 Expression of various circRNAs in PBMC of SLE patients and normal people(A)Expression of circLRRK2 in PBMCs from 49 patients with SLE and 37 healthycontrols. (B)Expression of circPPHLN1 in PBMCs from 49 patients with SLE and 37healthy controls. (C)Expression of circPTPN22 in PBMCs from 49 patients with SLEand 37 healthy controls. (D)Expression of circMYBL1 in PBMCs from 49 patientswith SLE and 37 healthy controls.
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本文編號：2844039