發(fā)布時間：2020-10-16 09:36

　　 第一部分GLP-1RA促進C3H10T1/2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞目的:研究表明胰高糖素樣肽1-受體激動劑(GLP-1RA)通過促進白色脂肪細(xì)胞棕色化而減輕體重,該基礎(chǔ)實驗旨在研究GLP-1RA(利拉魯肽)對C3H10T1/2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞的影響,并研究信號通路PI3K/AKT/mTOR在細(xì)胞分化過程中所起的作用。方法:將C3H10T1/2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的棕色脂肪細(xì)胞,從誘導(dǎo)細(xì)胞分化開始,使用利拉魯肽(10nM,100nM)和(或)PI3K抑制劑10μmol LY294002干預(yù)至第8天,無利拉魯肽及(或)LY294002干預(yù)為對照組,使用Annexin V法測細(xì)胞凋亡、CCK8法測細(xì)胞增殖,采用油紅O染色進行脂肪細(xì)胞脂滴染色并測OD值,使用實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測棕色脂肪細(xì)胞特異性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及線粒體功能相關(guān)基因(CytoC,COX II),mtDNA的表達(dá),使用Western Blot檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路在分化過程中的蛋白定量變化。結(jié)果:1.與對照組比,棕色脂肪細(xì)胞的細(xì)胞凋亡隨著利拉魯肽干預(yù)濃度增加而下降(P0.05),細(xì)胞增殖則逐漸上升(P0.05),10nM利拉魯肽作用使細(xì)胞分化第4,6,8天多腔脂滴形成及油紅O染色定量顯著多于對照組(P值均小于0.05),100nM利拉魯肽使細(xì)胞分化第2,4,6,8天多腔脂滴形成及油紅O染色定量顯著多于對照組(P值均小于0.05)。2.在細(xì)胞分化過程中,棕色脂肪細(xì)胞特異性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及線粒體功能相關(guān)基因(CytoC,COX II),及mtDNA的表達(dá)在利拉魯肽干預(yù)下顯著高于對照組,且隨著利拉魯肽干預(yù)濃度的增加表達(dá)量逐漸提高(P值均小于0.05)。3.在棕色脂肪細(xì)胞分化過程中,利拉魯肽干預(yù)下脂肪細(xì)胞的磷酸化AKT及mTOR蛋白定量水平逐漸增加,與對照組比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均小于0.05),且于分化第8天100nM利拉魯肽組磷酸化AKT及mTOR蛋白定量水平顯著高于10nM利拉魯肽組及對照組(P值均小于0.05)。4.在LY294002作用下,與對照組比,C3H10T1/2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為棕色脂肪細(xì)胞的數(shù)量減少,油紅O染色定量顯著下降,且棕色脂肪細(xì)胞特異性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及線粒體功能相關(guān)基因(CytoC,COX II),mtDNA,磷酸化AKT及mTOR蛋白定量水平均顯著降低(P值均小于0.05)。5.當(dāng)利拉魯肽及LY294002共同作用于細(xì)胞分化過程時,與100nM利拉魯肽干預(yù)組相比,油紅O染色定量,棕色脂肪細(xì)胞特異性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及線粒體功能相關(guān)基因(CytoC,Cox II),mtDNA,磷酸化AKT及mTOR表達(dá)水平均顯著下降或降低(P值均小于0.05)。結(jié)論:在C3H10T1/2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化過程中,GLP-1RA不僅能抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞增殖,也促進C3H10T1/2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中多腔脂滴的形成,且能促進C3H10T1/2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞,另外,信號通路PI3K/AKT/mTOR在GLP-1RA介導(dǎo)的促分化過程中起到重要作用。第二部分GLP-1RA對腹型肥胖2型糖尿病患者脂肪分布及胰島β細(xì)胞功能的影響目的:與西方人群相比,大多數(shù)中國2型糖尿病患者BMI并不高,然而卻表現(xiàn)出腹型肥胖的特征。既往研究顯示GLP-1RA能有效地控制肥胖2型糖尿病患者的血糖及體重,保護胰島β細(xì)胞功能,減少內(nèi)臟及肝臟脂肪沉積。本研究旨在研究GLP-1RA(艾塞那肽)對腹型肥胖的2型糖尿病患者的脂肪分布及胰島β細(xì)胞功能的作用。研究方法:對49名腹型肥胖2型糖尿病患者進行24周的治療干預(yù),在干預(yù)前、干預(yù)后檢測2型糖尿病患者體重、腰圍、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓、空腹血糖(FPG)、餐后2小時血糖(2h PBG)、糖化血紅蛋白(Hb A1c)、血脂、肝功能、腎功能、成纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF-21)、100g饅頭餐試驗,使用磁共振成像(MRI)測量皮下脂肪組織(SAT)及內(nèi)臟脂肪組織(VAT)、氫質(zhì)子磁共振波譜(1H-MRS)測量肝臟脂肪含量(LFC),以Matsuda指數(shù)(總體胰島素敏感性指數(shù))及MBCI指數(shù)(李-Bennett胰島B細(xì)胞功能指數(shù))評估胰島素敏感性及胰島β細(xì)胞功能,使用配對t檢驗,Wilcoxon檢驗及秩和檢驗,控制年齡及性別的混合效應(yīng)模型,Pearson相關(guān)性分析等統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析。結(jié)果:1.共40名2型糖尿病患者最終完成24周的治療和隨訪,所有2型糖尿病患者干預(yù)前、后空腹血糖為(9.14±2.41 mmol/L vs 8.01±2.03 mmol/L)、餐后2小時血糖為(15.95±4.28 mmol/L vs 14.38±3.37 mmol/L)、糖化血紅蛋白為(8.43±1.06%vs 7.05±1.04%),干預(yù)后血糖水平均較干預(yù)前顯著下降(P值均小于0.05)。2.與治療前相比,2型糖尿病患者在艾塞那肽治療干預(yù)后Matsuda指數(shù)無顯著變化,而MBCI指數(shù)則升高明顯(5.44±3.33 vs 7.27±5.04)(P=0.045)。3.艾塞那肽干預(yù)治療前、后,受試者體重為(68.08±9.28 kg vs 64.53±10.41 kg),腰圍為(88.83±5.58 cm vs 84.21±6.57 cm),BMI為(23.99±1.2 kg/m~2 vs 22.68±1.68 kg/m~2),治療24周后與治療前相比均下降顯著(P均小于0.01)。4.治療前、后受試者內(nèi)臟脂肪面積為(80.56±34.26 cm~2vs 66.82±30.07 cm~2)、LFC為(22.96±3.02%vs9.83±2.38%)、SAT為(129.85±43.73 cm~2vs 114.18±44.39 cm~2),24周艾塞那肽治療后均顯著下降(P值均小于0.01)。5.FGF-21與干預(yù)治療前相比,除在干預(yù)后顯著下降外(372.79±244.56 pg/ml vs 198.64±147.02 pg/ml)(P0.01),也與肝臟脂肪含量均呈正相關(guān)(r=0.248,P=0.027)。結(jié)論:艾塞那肽不僅能有效地控制腹型肥胖2型糖尿病患者的血糖及體重,也能改善患者胰島β細(xì)胞功能,減少內(nèi)臟及皮下脂肪組織、肝臟脂肪含量。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié) 果1 利拉魯肽抑制棕色脂肪細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞增殖，促進多腔脂滴的形成采用流式細(xì)胞儀（Annexin V 法）測棕色脂肪細(xì)胞分化第 8 天的細(xì)胞凋亡，在利拉魯肽（10nM，100nM）干預(yù)下，隨著利拉魯肽干預(yù)濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸下降（P 值均小于 0.05）（圖 1A，圖 1B）。

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文第 6 日、第 8 日逐漸增長；然而在 100nM 利拉魯肽作用下，細(xì)胞的油紅 O 染色定量在第 2 日明顯增加（圖 2B）。而在棕色脂肪細(xì)胞分化過程中，無論是對照組亦或是 10nM 利拉魯肽干預(yù)組，多腔脂滴于分化第 4 日出現(xiàn)，而在 100nM 利拉魯肽干預(yù)下，在分化第 2 日多腔脂滴已開始形成，而在分化第 8 日無論是 10nM利拉魯肽或是 100nM 利拉魯肽干預(yù)組，多腔脂滴的形成數(shù)量均明顯多于對照組，提示利拉魯肽顯著地促進了棕色脂肪細(xì)胞多腔脂滴的形成（圖 2C）。

（Pparγ），PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（Prdm16），Pgc-1α在細(xì)胞分化的第4日、第6日及第8日均增加明顯（P < 0.05），其中，Pparγ增加約2.6倍，Prdm16增加約1.6倍，而Pgc-1α則增加約2倍（圖3A）。而在100nM利拉魯肽干預(yù)下，與對照組相比，細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的DFFA樣效應(yīng)因子A（Cide-a）在細(xì)胞分化第2日及第4日無明顯差異，然而，兩組間的差異在分化第6日及第8日均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且在分化第8日，100nM利拉魯肽干預(yù)組Cide-a的RNA表達(dá)水平高于對照組2.7倍（圖3A）。此外，在細(xì)胞分化末期，100nM利拉魯肽干預(yù)組的Ucp1基因表達(dá)水平明顯高于10nM利拉魯肽干預(yù)組及對照組（P < 0.05）（圖3A）。圖 3 利拉魯肽促進 C3H10T1/2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟棕色脂肪細(xì)胞分化過程中棕色脂肪細(xì)胞特異性基因及線粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)（以 qPCR 檢測）A.細(xì)胞分化 2,4,6,8 天棕色脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，B.細(xì)胞分化 2,4,6,8 天 mtDNA 的表達(dá)
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本文編號：2843082