目的最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,目前全世界糖尿病的患病率為9.1%,患病人數(shù)已達(dá)4.51億,我國(guó)成人糖尿病患病率為10.9%,糖尿病患者達(dá)1.48億。而在所有糖尿病患者中約有1%-5%是由單基因突變引起,被稱為單基因突變糖尿病。其中鉀內(nèi)流通道亞家族成員11 J(KCNJ11)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)兩個(gè)單基因糖尿病基因已經(jīng)發(fā)展成治療T2D的主要藥物靶點(diǎn)。因此,單基因糖尿病是寶貴的“人體疾病模型”,有助于我們了解常見(jiàn)的T1D和T2D的病理生理基礎(chǔ),并為新藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供可能。最近,有學(xué)者報(bào)告一種新的綜合征,該綜合征主要臨床表現(xiàn)包括腦回簡(jiǎn)化的小頭畸形,癲癇和永久性新生兒糖尿病,英文全稱為Microcephaly-Epilepsy and Neonatal Diabetes Syndrome,簡(jiǎn)稱為MEDS�；驒z測(cè)顯示MEDS主要是由于IER3IP1基因突變?cè)斐�。本研究旨在探討IER3IP1蛋白特性,并在分子水平,細(xì)胞水平,動(dòng)物水平研究該蛋白在β細(xì)胞合成分泌胰島素過(guò)程中的作用,進(jìn)一步加深了解MEDS發(fā)病機(jī)制。方法1、通過(guò)免疫熒光研究IER3IP1在INS1細(xì)胞中的定位,通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建IER3IP1-/-敲除的293T細(xì)胞系(293T~(IER3IP1-/-)),在293T~(IER3IP1-/-)細(xì)胞系中通過(guò)加/不加DTT(DTT為一種還原劑,可以打開(kāi)胰島素內(nèi)部的二硫鍵,破壞原有構(gòu)象,通過(guò)加用和不加用相比,可以判斷是否存在錯(cuò)誤折疊)處理應(yīng)用蛋白雜交實(shí)驗(yàn)(Western Blotting,WB)分析IER3IP1敲除及突變后對(duì)胰島素原合成、折疊、分泌的影響,并給予β細(xì)胞系、小鼠胰島糖刺激,觀察IER3IP1蛋白的表達(dá)變化。2、構(gòu)建IER3IP1-/-動(dòng)物模型,觀察IER3IP1-/-小鼠體重、血糖變化情況,摘取不同時(shí)期IER3IP1-/-小鼠胰腺,進(jìn)行HE染色,統(tǒng)計(jì)胰島占胰腺面積比值變化情況;進(jìn)行免疫組化及免疫熒光染色,觀察胰島素原、胰島素含量及定位變化,胰島α、β、δ細(xì)胞分布改變;進(jìn)行電鏡掃描,觀察細(xì)胞器結(jié)構(gòu)變化;結(jié)果1、在INS1細(xì)胞中的研究結(jié)果表明IER3IP1蛋白既定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又定位于高爾基體,人體胰腺標(biāo)本的免疫熒光結(jié)果與INS1細(xì)胞系中的結(jié)果一致;應(yīng)用蛋白質(zhì)構(gòu)象模擬軟件預(yù)測(cè)IER3IP1為N端和C端各一α螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白,V12G(M1)突變和L78P(M2)突變分別影響了N端和C端的α螺旋結(jié)構(gòu);正常情況下IER3IP1蛋白不分泌至細(xì)胞外,突變后同樣不分泌至細(xì)胞外;高糖刺激(25.5mmol/L)會(huì)上調(diào)IER3IP1表達(dá)。2、在293T細(xì)胞中研究表明,與過(guò)表達(dá)IER3IP1蛋白相比,表達(dá)M1突變型IER3IP1蛋白,可使細(xì)胞分泌效率降低21.1%,表達(dá)M2突變型IER3IP1蛋白,可降低細(xì)胞分泌降低91.6%;應(yīng)用同位素示蹤法研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)IER3IP1會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞分泌新合成胰島素能力,與過(guò)表達(dá)IER3IP1蛋白相比,表達(dá)M1突變型IER3IP1蛋白,可使細(xì)胞分泌降低降低37.1%,表達(dá)M2突變型IER3IP1蛋白,可降低細(xì)胞分泌效率45.7%;應(yīng)用shRNA敲降IER3IP1蛋白,敲降效率為62.9%時(shí),可使細(xì)胞分泌效率下降55%,敲降效率為78.5%時(shí),可使細(xì)胞分泌效率下降86.6%;293T ~(IER3IP1-/-)細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)也證實(shí)IER3IP1敲除后細(xì)胞分泌胰島素原功能顯著下降。3、與C57BL/6小鼠相比,3周齡IER3IP1-/-小鼠空腹血糖正常(6.1mmol/L VS 6.3mmol/L),體重基本正常(6.5g VS 6.03g),胰島大小、形態(tài)正常,但胰島占胰腺面積下降約13.6%(14.25‰VS 12.31‰);4周齡IER3IP1-/-小鼠出現(xiàn)明顯空腹血糖升高(8.4mmol/L VS 19.2mmol/L),體重增加減慢(10.1g VS 8.9g);8周齡IER3IP1-/-小鼠,空腹血糖顯著增高(7.6mmol/L VS 22.4mmol/L),體重明顯減低(19.4g VS 15.5g),胰島占胰腺面積下降90.2%(3.656‰VS 0.358‰)。4、發(fā)病IER3IP1-/-小鼠胰腺HE染色結(jié)果表明,與正常C57BL/6小鼠胰島細(xì)胞排列整齊、規(guī)則,細(xì)胞核呈(類)圓形,大小較均一,多數(shù)呈淺著色,胞漿豐富,胞核居中相比,IER3IP1-/-小鼠胰島細(xì)胞排列不規(guī)則,局部呈“擁擠狀”,細(xì)胞核可見(jiàn)規(guī)則圓形,亦可見(jiàn)較多(類)橢圓形,部分細(xì)胞胞漿欠豐富,胞核靠近細(xì)胞膜;免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),與C57BL/6小鼠胰島胰島素原聚集在β細(xì)胞核周(高爾基體位置)不同,IER3IP1-/-小鼠胰島β細(xì)胞幾乎看不到核周的胰島素原聚集;而且IER3IP1-/-小鼠β細(xì)胞胰島素含量明顯減低;電鏡掃描顯示β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變粗,胰島素分泌顆粒明顯減少,并出現(xiàn)大量空泡化線粒體,以及線粒體吞噬囊泡現(xiàn)象;通過(guò)WB法檢測(cè)胰島相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果顯示與C57BL/6小鼠相比,IER3IP1-/-小鼠胰島素表達(dá)量降低最高可達(dá)93.3%,胰島素原與胰島素比值顯著增高可達(dá)6.34倍;與C57BL/6小鼠相比,4周齡IER3IP1-/-小鼠胰島p-eIF2α/eIF2α比值降低18.2%,14周齡IER3IP1-/-小鼠胰島p-eIF2α/eIF2α比值降低42.8%。結(jié)論1、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了293T~(IER3IP1-/-)細(xì)胞系,成功構(gòu)建IER3IP1-/-小鼠模型。2、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)IER3IP1蛋白既定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又定位于高爾基體;IER3IP1蛋白正常情況下和突變后均不分泌至細(xì)胞外;高糖刺激可以誘導(dǎo)IER3IP1蛋白表達(dá)上調(diào);3、本實(shí)驗(yàn)在293T細(xì)胞中證實(shí)過(guò)表達(dá)IER3IP1蛋白可以增強(qiáng)細(xì)胞分泌功能,敲除或突變IER3IP1蛋白后會(huì)抑制細(xì)胞分泌功能,增加胰島素原的錯(cuò)誤折疊;4、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)IER3IP1-/-小鼠3周時(shí)出現(xiàn)β細(xì)胞功能障礙,4周時(shí)出現(xiàn)顯著高血糖,發(fā)病的IER3IP1-/-小鼠β細(xì)胞合成胰島素下降,胰島素原錯(cuò)誤折疊增加,胰島素原不能正常向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn),且出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變粗,大量線粒體空泡化及線粒體吞噬囊泡現(xiàn)象。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

-DIER3IP1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位

我們?cè)?INS1 細(xì)胞系中通過(guò)免疫熒光法單通道染色 IER3IP1 蛋白，發(fā)現(xiàn)IER3IP1 蛋白呈彌散狀分布在細(xì)胞漿中，在核周存在高熒光信號(hào)（如圖 1A 所示）。為進(jìn)一步明確 IER3IP1 蛋白具體的細(xì)胞器定位，我們對(duì) IER3IP1 蛋白與 PDI（內(nèi)質(zhì)網(wǎng) marker），GM130（高爾基體 marker）分別雙染。如圖 1B 所示，紅光代表IER3IP1 蛋白，綠光代表 PDI，二者融合后呈黃色，提示 IER3IP1 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。如圖 1C 所示，紅光代表 IER3IP1 蛋白，綠光代表 GM130，二者融合后也呈黃色，這提示 IER3IP1 蛋白也定位于高爾基體。我們還在人胰腺中進(jìn)行了IER3IP1 蛋白的單通道染色，結(jié)果如圖 1D 所示，與在 INS1 細(xì)胞中類似，IER3IP1蛋白在細(xì)胞部分區(qū)域內(nèi)呈彌散狀分布，在核周可見(jiàn)高熒光信號(hào)濃集區(qū)。2.2 高糖刺激對(duì) IER3IP1 蛋白表達(dá)影響我們以 2.5mmol/L 低糖培養(yǎng)做為對(duì)照，觀察了 25.5mmol/L 高糖刺激 INS1細(xì)胞對(duì) IER3IP1 蛋白表達(dá)影響，刺激時(shí)間為 6 小時(shí)，結(jié)果如圖 2A-B 所示，與低糖刺激相比，25.5mmol/L 高糖刺激可以誘導(dǎo) IER3IP1 表達(dá)上調(diào)約 29.4%。我們?cè)谝葝u原代細(xì)胞中也進(jìn)行了同樣的糖刺激實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與 INS1 細(xì)胞系一致。

M1 突變型、M2 突變型 IER3IP1 蛋白的高級(jí)構(gòu)象，如圖 3A-C 所示，圖 A 為野生型 IER3IP1 蛋白構(gòu)象預(yù)測(cè)，N 端和 C 端各為一 α 螺旋結(jié)構(gòu)，中間為一β折疊的鏈狀結(jié)構(gòu)連接；M1 突變后造成 N 端α螺旋結(jié)構(gòu)破壞；M2 突變后造成了 C 端α螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。我們?cè)?293T 細(xì)胞中觀察了內(nèi)源性及外源性 IER3IP1 蛋白表達(dá)及分泌情況，如圖 4 所示，293T 不給予任何處理、轉(zhuǎn)染胰島素原和空載體時(shí)，上清液（medium）中幾乎檢測(cè)不到 IER3IP1 蛋白（medium 中的少許考慮為旁逸），結(jié)果提示生理情況下，IER3IP1 蛋白不分泌至細(xì)胞外，給予 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性野生型IER3IP1 質(zhì)粒和胰島素原時(shí)，上清液中同樣未檢測(cè)到 IER3IP1 蛋白，由于轉(zhuǎn)染的IER3IP1 質(zhì)粒帶有一 his-tag 標(biāo)簽，因此較內(nèi)源性 IER3IP1 蛋白分子量增加，故在WB 檢測(cè)結(jié)果中略高于內(nèi)源性 IER3IP1 蛋白條帶。轉(zhuǎn)染野生型 IER3IP1 質(zhì)粒及胰島素原后，內(nèi)源性與外源性 IER3IP1 蛋白均不分泌至細(xì)胞外（上清液中未檢測(cè)到），同理，在 293T 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 M1 突變型質(zhì)粒+胰島素原質(zhì)粒和 M2 突變型質(zhì)粒+胰島素原后，上清液中均未檢測(cè)內(nèi)源性或外源性 IER3IP1 蛋白突變后，這表明 M1 突變和 M2 突變都沒(méi)有造成 IER3IP1 分泌至細(xì)胞外。
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