目的：糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的并發(fā)癥之一,它已經(jīng)成為引起終末期腎病(end-stage renal disease ESRD)的主要原因。在非脂肪組織中,脂質(zhì)超負(fù)荷會(huì)使循壞和胞質(zhì)中的脂質(zhì)分解和合成平衡紊亂,發(fā)生了脂質(zhì)的異常堆積,這被稱之為脂毒性。研究證明脂毒性與很多代謝綜合征的病理生理學(xué)機(jī)制相關(guān),特別是2型糖尿病(T2DN)及其并發(fā)癥。β-氧化是脂肪酸分解代謝的主要途徑且為腎臟ATP產(chǎn)生的主要來源。乙酰輔酶A羧化酶2(Acetyl-CoA carboxylase 2, ACC2)是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶并催化乙酰輔酶A羧化為丙二酰輔酶A,而丙二酰輔酶A是脂肪酸氧化的一個(gè)關(guān)鍵代謝產(chǎn)物,通過抑制肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(CPTI)來限制脂肪酸β氧化,是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶。自噬因能控制細(xì)胞能量平衡而被熟知。但是自噬與脂肪酸β氧化兩者相互間的關(guān)系仍然未知。本研究旨在探討：ACC2在棕櫚酸(palmitic acid, PA)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞脂毒性中的作用和自噬在這個(gè)過程中可能起到的作用。方法：1.用300 uM棕櫚酸處理HK2細(xì)胞特定的時(shí)間,并以BSA作為對照組。用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積。用CCK-8來觀察細(xì)胞活性。用PI染色來觀察細(xì)胞死亡情況。2.用qPCR的方法觀察：棕櫚酸及BSA分別刺激HK2細(xì)胞后ACC2的nRNA水平。用免疫組化的方法觀察：高脂喂養(yǎng)的大鼠與正常喂養(yǎng)大鼠ACC2和pACC2的表達(dá)水平。3.使用shRNA慢病毒感染HK2細(xì)胞使ACC2的表達(dá)發(fā)生變化,并用VesrernBlot方法來驗(yàn)證敲除效率,之后用300 uM PA處理轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞72小時(shí)。用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積。用CCK-8來觀察細(xì)胞活性。4.PA處理HK2細(xì)胞后觀察自噬表達(dá)水平。不同濃度PA刺激HK2細(xì)胞2小時(shí)后,用Western blotting檢測LC3, Beclin-l and p62,用透射電鏡以及mRFP-GFP-LC3腺病毒干擾的方法檢測HK2細(xì)胞的自噬情況。5.用Western Blot、RT-qPCR及免疫組化的方法檢測高脂飲食大鼠以及正常喂養(yǎng)大鼠體內(nèi)LC3, Beclin-1 和 p62的表達(dá)水平。6.改變p-氧化后觀察自噬改變情況。分別用ACC2kd (ACC2 shRNA knockdown, ACC2kd)細(xì)胞及80 uM Etomoxir處理HK2細(xì)胞后觀察自噬。用Western Blot檢測LC3, Beclin-1 和 p62蛋白水平。用LC3免疫熒光的共聚焦顯微鏡來觀察各組自噬的改變情況。7.使用戶Ltg5 siRN A感染HK2細(xì)胞,使Atg5表達(dá)降低,并用Wesrern Blot方法驗(yàn)證敲除效率。分別用PA刺激ACC2 D的HK2細(xì)胞、Atg5KD的HK2細(xì)胞以及兩者共同敲除的HK2細(xì)胞,使用CCK8的方法觀察細(xì)胞活性。結(jié)果：1.在PA刺激24h觀察到HK2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,隨著時(shí)間的增長呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。細(xì)胞活性在PA處理(P0.05)后48小時(shí)下降明顯,72小時(shí)進(jìn)一步降低。PA刺激HK2細(xì)胞死亡明顯。2.用qPCR檢測PA刺激HK2細(xì)胞,ACC2的mRNA(P0.05)水平比正常HK2細(xì)胞明顯增高。高脂喂養(yǎng)大鼠相比正常喂養(yǎng)大鼠,前者ACC2表達(dá)升高且pACC2表達(dá)明顯降低。3.ACC2kd細(xì)胞在PA刺激72小時(shí)后脂質(zhì)沉積明顯減少且細(xì)胞活性(P0.05)較單純PA刺激的HK2細(xì)胞也有明顯改善。4.檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62蛋白表達(dá)均表明：PA刺激HK2細(xì)胞時(shí),自噬從最低濃度100 uM PA刺激時(shí)被激活,并呈現(xiàn)濃度依賴性(P0.05)。透射電鏡及mRFP-GFP-LC3的腺病毒感染也得出相同結(jié)論。5.無論在蛋白水平還是mRNA水平,高脂喂養(yǎng)大鼠相比正常喂養(yǎng)大鼠,自噬都被激活。6.ACC2kd細(xì)胞降低了PA刺激后自噬(P0.05)的水平。7.PA刺激HK2細(xì)胞,ACC2或Atg5基因沉默組HK2細(xì)胞活性與單純PA刺激的細(xì)胞相比,基因沉默組細(xì)胞活性有所恢復(fù),但是雙基因的沉默并沒有使細(xì)胞活性有更加顯著的恢復(fù)。結(jié)論：在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中脂質(zhì)代謝功能障礙時(shí)自噬被激活。體外實(shí)驗(yàn)中,通過下調(diào)乙酰輔酶A羧化酶2水平調(diào)節(jié)自噬可改善由棕櫚酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的脂毒性。根據(jù)目前的研究表明,ACC2調(diào)節(jié)自噬的活動(dòng),這提供了PA誘導(dǎo)的腎脂毒性一種新型的分子機(jī)制。這些信號(hào)通路的藥物靶向可能有助于設(shè)計(jì)出一種新的方式預(yù)防代謝綜合征時(shí)腎功能惡化的治療策略。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

圖２．高脂環(huán)境下ＰＡ使ＡＣＣ２的表達(dá)X椉�。辶x希ǎ粒校鏈倘齙模齲耍蠶赴粒茫茫蒼冢恚遙危料嘍員澩鎪�。辶x希ǎ攏粒茫茫駁姆腔罨問劍穡粒茫茫燦脛舅嵫躉墓叵蹈蟆ｅ義

本文編號(hào)：2833463