目的：糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的并發(fā)癥之一,它已經(jīng)成為引起終末期腎病(end-stage renal disease ESRD)的主要原因。在非脂肪組織中,脂質超負荷會使循壞和胞質中的脂質分解和合成平衡紊亂,發(fā)生了脂質的異常堆積,這被稱之為脂毒性。研究證明脂毒性與很多代謝綜合征的病理生理學機制相關,特別是2型糖尿病(T2DN)及其并發(fā)癥。β-氧化是脂肪酸分解代謝的主要途徑且為腎臟ATP產(chǎn)生的主要來源。乙酰輔酶A羧化酶2(Acetyl-CoA carboxylase 2, ACC2)是脂肪酸代謝的關鍵酶并催化乙酰輔酶A羧化為丙二酰輔酶A,而丙二酰輔酶A是脂肪酸氧化的一個關鍵代謝產(chǎn)物,通過抑制肉堿棕櫚酰轉移酶I(CPTI)來限制脂肪酸β氧化,是脂肪酸代謝的關鍵酶。自噬因能控制細胞能量平衡而被熟知。但是自噬與脂肪酸β氧化兩者相互間的關系仍然未知。本研究旨在探討：ACC2在棕櫚酸(palmitic acid, PA)誘導人腎小管上皮細胞脂毒性中的作用和自噬在這個過程中可能起到的作用。方法：1.用300 uM棕櫚酸處理HK2細胞特定的時間,并以BSA作為對照組。用油紅O染色觀察細胞內脂質的沉積。用CCK-8來觀察細胞活性。用PI染色來觀察細胞死亡情況。2.用qPCR的方法觀察：棕櫚酸及BSA分別刺激HK2細胞后ACC2的nRNA水平。用免疫組化的方法觀察：高脂喂養(yǎng)的大鼠與正常喂養(yǎng)大鼠ACC2和pACC2的表達水平。3.使用shRNA慢病毒感染HK2細胞使ACC2的表達發(fā)生變化,并用VesrernBlot方法來驗證敲除效率,之后用300 uM PA處理轉染HK2細胞72小時。用油紅O染色觀察細胞內脂質的沉積。用CCK-8來觀察細胞活性。4.PA處理HK2細胞后觀察自噬表達水平。不同濃度PA刺激HK2細胞2小時后,用Western blotting檢測LC3, Beclin-l and p62,用透射電鏡以及mRFP-GFP-LC3腺病毒干擾的方法檢測HK2細胞的自噬情況。5.用Western Blot、RT-qPCR及免疫組化的方法檢測高脂飲食大鼠以及正常喂養(yǎng)大鼠體內LC3, Beclin-1 和 p62的表達水平。6.改變p-氧化后觀察自噬改變情況。分別用ACC2kd (ACC2 shRNA knockdown, ACC2kd)細胞及80 uM Etomoxir處理HK2細胞后觀察自噬。用Western Blot檢測LC3, Beclin-1 和 p62蛋白水平。用LC3免疫熒光的共聚焦顯微鏡來觀察各組自噬的改變情況。7.使用戶Ltg5 siRN A感染HK2細胞,使Atg5表達降低,并用Wesrern Blot方法驗證敲除效率。分別用PA刺激ACC2 D的HK2細胞、Atg5KD的HK2細胞以及兩者共同敲除的HK2細胞,使用CCK8的方法觀察細胞活性。結果：1.在PA刺激24h觀察到HK2細胞內脂質沉積,隨著時間的增長呈現(xiàn)時間依賴性。細胞活性在PA處理(P0.05)后48小時下降明顯,72小時進一步降低。PA刺激HK2細胞死亡明顯。2.用qPCR檢測PA刺激HK2細胞,ACC2的mRNA(P0.05)水平比正常HK2細胞明顯增高。高脂喂養(yǎng)大鼠相比正常喂養(yǎng)大鼠,前者ACC2表達升高且pACC2表達明顯降低。3.ACC2kd細胞在PA刺激72小時后脂質沉積明顯減少且細胞活性(P0.05)較單純PA刺激的HK2細胞也有明顯改善。4.檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin1和p62蛋白表達均表明：PA刺激HK2細胞時,自噬從最低濃度100 uM PA刺激時被激活,并呈現(xiàn)濃度依賴性(P0.05)。透射電鏡及mRFP-GFP-LC3的腺病毒感染也得出相同結論。5.無論在蛋白水平還是mRNA水平,高脂喂養(yǎng)大鼠相比正常喂養(yǎng)大鼠,自噬都被激活。6.ACC2kd細胞降低了PA刺激后自噬(P0.05)的水平。7.PA刺激HK2細胞,ACC2或Atg5基因沉默組HK2細胞活性與單純PA刺激的細胞相比,基因沉默組細胞活性有所恢復,但是雙基因的沉默并沒有使細胞活性有更加顯著的恢復。結論：在體內、外實驗中脂質代謝功能障礙時自噬被激活。體外實驗中,通過下調乙酰輔酶A羧化酶2水平調節(jié)自噬可改善由棕櫚酸誘導的腎小管上皮細胞的脂毒性。根據(jù)目前的研究表明,ACC2調節(jié)自噬的活動,這提供了PA誘導的腎脂毒性一種新型的分子機制。這些信號通路的藥物靶向可能有助于設計出一種新的方式預防代謝綜合征時腎功能惡化的治療策略。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

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本文編號：2833463