【研究目的】通過測定百草枯中毒大鼠肺組織氧化應激水平、細胞因子水平以及TGF-β1/Smad信號通路關鍵蛋白表達的變化情況,探討橙皮素干預對百草枯所致大鼠肺損傷的保護作用及可能的作用機制�！狙芯糠椒ā繉�140只Wistar雄性大鼠隨機分為陰性對照組、橙皮素對照組、百草枯模型組、吡非尼酮對照組、橙皮素低、中、高劑量治療組,每組20只。陰性對照組和橙皮素對照組不染毒,其他各組均以50mg/kg百草枯一次性灌胃染毒,建立大鼠百草枯致大鼠肺纖維化動物模型。染毒24小時后對各組分別給予相應藥物干預,每天灌胃給藥一次。大鼠染毒后第7d、28d每組隨機處死10只大鼠,隨機選其中3只大鼠取其肺組織行HE、Masson染色,觀察比較不同時間點各組大鼠肺組織肺泡炎及肺纖維化病變程度;應用堿水解法測定不同時間點各組大鼠肺組織勻漿液中羥脯氨酸(HYP)含量,判斷肺組織膠原纖維沉積情況;采用各指標試劑盒檢測不同時間點各組大鼠肺組織中丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和總抗氧化能力(T-AOC)活力;采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測不同時間點各組大鼠肺組織中轉化生長因子-β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)、干擾素-γ(IFN-γ)的水平;采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)測定染毒后不同時間點各組大鼠肺組織中Smad2/3和Smad7 mRNA表達水平變化情況,采用蛋白質免疫印跡法(Western blot)測定染毒后不同時間點各組大鼠肺組織中Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白表達水平變化情況。應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對計量資料及病理半定量資料結果進行分析。【研究結果】1.動物一般情況陰性對照組和橙皮素對照組大鼠飲食、活動狀況正常,毛發(fā)光滑;模型組大鼠飲食量減少,毛發(fā)干枯稀疏,精神萎靡不振,部分大鼠出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象,體重較陰性對照組生長緩慢,部分大鼠呼吸困難并伴有濕鑼音,于造模后第2天死亡1只。吡非尼酮對照組大鼠飲食較為正常,毛發(fā)尚可,體重增長良好,于造模后第11天死亡1只。橙皮素低劑量治療組大鼠毛發(fā)略有干枯現(xiàn)象,飲食較陰性對照組有所減少,體重增長較為緩慢。橙皮素中、高劑量治療組大鼠毛發(fā)尚可,飲食和體重增長情況較為正常,呼吸困難癥狀有所減輕,精神狀態(tài)良好。2.組織病理學檢查百草枯染毒7d后大鼠肺組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)百草枯模型組大鼠出現(xiàn)以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤,部分組織結構遭到破壞;經(jīng)吡非尼酮和橙皮素治療后,大鼠肺組織炎性浸潤程度有所減少,肺泡結構更完整;百草枯染毒28d后大鼠模型組肺組織肺泡炎減少,膠原纖維沉積明顯增多,肺纖維化程度加重,經(jīng)吡非尼酮和橙皮素治療后大鼠肺組織纖維化程度均有所減輕。大鼠肺泡炎半定量分析結果顯示,百草枯模型組肺泡炎評分較正常對照組有顯著升高(P0.01),治療后第7d、28d吡非尼酮對照組和橙皮素各劑量治療組肺泡炎評分較模型組有不同程度的降低(P0.05,P0.01)。百草枯模型組第28d肺纖維化評分較正常對照組顯著升高(P0.01),吡非尼酮對照組和橙皮素各劑量治療組第28d肺纖維化評分較PQ模型組有不同程度的降低(P0.05,P0.01)。3.各組大鼠肺組織中MDA、SOD、CAT、GSH-PX和T-AOC水平變化陰性對照組與橙皮素對照組大鼠肺組織中各氧化指標水平之間無統(tǒng)計學差異(P0.05);與陰性對照組比較,百草枯染毒后模型組大鼠肺組織中MDA水平顯著升高(P0.01),SOD、CAT和GSH-PX活力明顯降低(P0.05)。經(jīng)吡非尼酮和橙皮素干預后MDA水平明顯降低(P0.05,P0.01),SOD、CAT和GSH-PX活力出現(xiàn)不同程度的升高(P0.05,P0.01)。4.各組大鼠肺組織中TGF-β1、IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平變化陰性對照組與橙皮素對照組大鼠肺組織中各炎性指標水平之間無統(tǒng)計學差異(P0.05);與陰性對照組比較,百草枯染毒后模型組大鼠肺組織中TGF-β1、IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10水平均顯著升高(P0.01),IFN-γ水平無顯著性差異(P0.05);經(jīng)吡非尼酮和橙皮素干預后炎性因子水平較模型組明顯降低(P0.05,P0.01),抗炎因子水平有所升高(P0.05,P0.01)。5.各組大鼠肺組織中Smad2/3和Smad7 mRNA表達變化情況陰性對照組與橙皮素對照組大鼠肺組織中各指標水平之間無統(tǒng)計學差異(P0.05);與陰性對照組比較,百草枯染毒后模型組大鼠肺組織中Smad2/3 mRNA表達水平在兩個時間點均有顯著升高(P0.05,P0.01),而Smad7 mRNA表達水平有下降趨勢,于纖維化形成期差異更為明顯(P0.05);經(jīng)吡非尼酮和橙皮素干預后Smad2/3 mRNA表達水平較模型組明顯降低(P0.05,P0.01),Smad7 mRNA表達水平較模型組明顯升高(P0.01)。6.各組大鼠肺組織中Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白表達變化情況大鼠染毒后第7d、28d橙皮素對照組大鼠肺組織中Smad2、P-Smad2/3蛋白表達水平較陰性對照組無統(tǒng)計學差異(P0.05),大鼠染毒后第7d橙皮素對照組大鼠肺組織中Smad3蛋白表達水平較陰性對照組有所升高(P0.05),而染毒后第28d橙皮素對照組大鼠肺組織中Smad3蛋白表達水平較陰性對照組有所降低(P0.05),大鼠染毒后兩個時間點橙皮素對照組大鼠肺組織中Smad7蛋白表達水平較陰性對照組明顯升高(P0.05,P0.01)。百草枯模型組大鼠肺組織中Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達水平較陰性對照組均有所升高(P0.01),Smad7蛋白表達水平較陰性對照組有所降低(P0.01);經(jīng)治療后第7d吡非尼酮對照組和橙皮素各劑量治療組大鼠肺組織中Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達水平較模型組均有不同程度的下降(P0.05,P0.01),而經(jīng)治療后第7d大鼠肺組織中Smad7蛋白表達水平較百草枯模型組顯著增加(P0.01),第28d吡非尼酮對照組大鼠肺組織中Smad7蛋白表達水平較百草枯模型組顯著增加(P0.01),橙皮素各劑量治療組高鼠肺組織中Smad7蛋白表達水平較百草枯模型組差異不顯著(P0.05)�！狙芯拷Y論】1.百草枯中毒可導致大鼠體內(nèi)氧化-抗氧化狀態(tài)失衡,繼而損傷肺組織。橙皮素能夠抑制百草枯中毒大鼠肺組織中氧化因子水平,提高抗氧化因子水平,從而減輕百草枯對肺組織的損傷作用;2.橙皮素可抑制百草枯中毒大鼠肺組織中炎性因子的釋放,并促進分泌抗炎因子,從而減輕百草枯對肺組織的損傷作用;3.橙皮素能夠抑制致百草枯中毒大鼠肺組織中纖維化因子TGF-β1的合成與分泌,降低百草枯中毒大鼠肺組織中Smad2/3 mRNA和蛋白及p-Smad2/3蛋白表達水平,提高Smad7 mRNA和蛋白表達水平,從而阻斷TGF-β1/Smad信號通路,減輕肺組織損傷;4.結合肺組織病理學研究發(fā)現(xiàn),百草枯中毒大鼠肺組織損傷隨橙皮素劑量增大而減輕,提示橙皮素有待成為治療百草枯中毒的新藥物,為今后指導橙皮素的開發(fā)及應用于臨床提供了可靠的藥理學依據(jù)。
【學位單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R595.4
【部分圖文】：

橙皮素對百草枯中毒大鼠肺組織損傷保護作用的實驗研究。內(nèi)液體清除，用洗滌液將各孔注滿，15s 后甩干，洗滌 5 次后可用。按同樣順序向各孔加入 100μl TMB Substrate Solution，置于室溫（min，每孔加入 100μl 終止液。酶標儀波長為 450nm 處檢測各孔 OD 值，檢測要在終止反應的 1 Curve Expert 1.4 專業(yè)作圖軟件，作出 TGF-β1 標準曲線圖和回歸濃度時可將樣品 OD 值代入方程式，所得濃度乘以樣品稀釋倍數(shù)即，標準曲線見圖 5。-128.682750.28x-768.482y x

圖 6 大鼠 TNF-α ELISA 試劑盒標準曲線組織中 IL-4 測定（ELISA 法）原理準品中的大鼠IL-4抗原結合相對應的抗體，洗板后加入HRP酶標的酶與底物發(fā)生顯色反應，可通過檢測固定好酶的含量推算出樣定量分析。配制 試劑配制步驟。步驟盒中所有試劑置于室溫至少 30min，嚴格按照說明書對各試劑進標板，確定 7 個標準孔、2 個空白孔和樣品孔，用洗滌液將各孔

器吸取 0.06ml Streptavidin-HRP，加入 11.94ml 配好的緩沖液，混孔加入 100μl Streptavidin-HRP，貼上封膜，置于室溫（18~25℃）液體清除，用洗滌液將各孔注滿，15s 后甩干，洗滌 3 次后用吸同樣順序向各孔加入 100μl TMB Substrate Solution，置于室溫（in，每孔加入終止液 100μl。標儀波長為 450nm 處檢測各孔 OD 值，檢測要在終止反應的 10Curve Expert 1.4 專業(yè)作圖軟件，作出 IL-4 標準曲線圖和回歸方程可將樣品 OD 值代入方程式，所得濃度乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣線見圖 7。

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 耿艷艷;周植星;胡倩倩;于冰;徐為人;湯立達;;特發(fā)性肺纖維化治療靶點及藥物研究進展[J];中國新藥雜志;2015年01期

2 史曉峰;張s

本文編號：2833216