目的:體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞,應(yīng)用N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體的非競爭性拮抗劑地卓西平(dizocilpine,MK-801)作為保護神經(jīng)的工具藥,通過檢測細胞活性、細胞凋亡、細胞內(nèi)Ca2+熒光、NMDA受體亞基蛋白及其磷酸化蛋白的表達,探討在氟中毒引起神經(jīng)系統(tǒng)的損傷中NMDA受體參與的機制。方法:體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞,用不同濃度的Na F和MK-801對細胞進行干預(yù)處理,將細胞分為六組:(1)正常對照組;(2)低氟組(0.2mmol/L Na F);(3)高氟組(2mmol/L Na F);(4)拮抗劑對照組(10μmol/L MK-801);(5)低氟拮抗劑組(0.2mmol/L Na F+10μmol/L MK-801);(6)高氟拮抗劑組(2mmol/L Na F+10μmol/L MK-801)。CCK-8法檢測細胞增殖活性,篩選出Na F和MK-801的合適用藥濃度;Fluo-3-AM細胞內(nèi)鈣離子熒光染色檢測細胞內(nèi)Ca2+的濃度;采用Annexin V-FITC和PI雙染色法,用流式細胞儀測定細胞凋亡率;western blot法檢測NMDA受體各亞單位蛋白NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B及相應(yīng)phospho-NMDAR1、phospho-NMDAR2A和phospho-NMDAR2B的表達。運用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析結(jié)果。結(jié)果:1.Na F對SH-SY5Y細胞的損傷程度呈濃度和時間依賴性,最終低氟選用Na F濃度為0.2mmol/L,高氟選用Na F濃度為2mmol/L,MK-801用藥濃度為10μmol/L。2.細胞內(nèi)Ca2+濃度結(jié)果:與對照組比較,低氟和高氟組細胞內(nèi)Ca2+平均熒光值均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,加入MK-801后高氟組細胞內(nèi)Ca2+平均熒光值均明顯減弱(P均小于0.05)。3.細胞凋亡結(jié)果:與對照組比較,低氟組中細胞凋亡率無明顯變化,加入MK-801后也無變化趨勢。高氟組的細胞凋亡率明顯升高,高氟組細胞使用MK-801后凋亡率有所下降(P0.05)。4.NMDA蛋白表達:與對照組比較,高氟組NMDAR1、NMDAR2A、phospho-NMDAR1、phospho-NMDAR2B蛋白表達量上調(diào)(P0.05)。這些上調(diào)表達可以被MK-801逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:NMDA受體參與過量氟暴露致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機制,可能是通過NMDA受體亞基磷酸化,使得NMDA受體過度活化,Ca2+大量內(nèi)流,導(dǎo)致神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡和壞死。
【學(xué)位單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R595
【部分圖文】：

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

同作用時間 SH-SY5Y 細胞的活性情況，其結(jié)果如圖 2-1 所示：低.24mmol/L）對 SH-SY5Y 細胞有輕微的促進生長作用，但隨著氟濃，細胞的存活率隨之減低，呈反比關(guān)系；高濃度的氟作用 36h 和 48活率的降低較作用 12h 和 24h 更加顯著。當(dāng) NaF 濃度為 2mmol/L時 SH-SY5Y 細胞的存活率約為 75%，作用 24 小時細胞存活率約6 小時細胞存活率約為 23%，作用 48 小時細胞存活率約為 19%。 24 小時作為最佳藥物刺激時間，2mmol/L 的 NaF 作為高氟組，相mmol/L 的 NaF 作為低氟組。

如圖 2-2、圖 2-3 所示，SH-SY5Y 細胞內(nèi)鈣離子經(jīng)熒光探針 fluo3-AM 染色后，使用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi) Ca2+表達情況發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，低氟組中SH-SY5Y 細胞內(nèi) Ca2+（綠色熒光）表達信號增強；而高氟組中 SH-SY5Y 細胞數(shù)目減少，細胞變圓，但細胞內(nèi) Ca2+熒光顏色更深，呈亮綠色熒光；與單獨高氟組相比較，加入抑制劑 MK-801 后，Ca2+熒光強度趨勢明顯減弱。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Bowen Qin;Yongping LIU;Kai CAO;Yumei WANG;Yazhen SHANG;;The Effects of Flavonoids from Scutellaria Stem and Leaf on the Expression of NMDAR and VEGF in Chronic Cerebral Ischemia Rats[J];Medicinal Plant;2013年04期

2 王卉;;Research on the relationship between NR3A subunit of NMDAR and brain hypoxia and ischemia[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2012年03期

3 單巍松,張國榮,張月華,梁英武,李春英,吳希如;遺傳性癲癇易感大鼠腦內(nèi)NMDAR1基因表達[J];生物化學(xué)與生物物理進展;1997年01期

4 梁輝,范金英,李愛華,周盛年,李強,朱海波;羥基紅花黃色素A對大鼠局灶性腦缺血再灌注NMDAR_1蛋白表達的影響[J];中華老年心腦血管病雜志;2004年03期

5 尚宇;顧佩菲;楊聞宇;周凱泉;趙t

本文編號：2832831