第一部分一例百草枯中毒死亡患者肺部組織免疫組化病理研究和文獻(xiàn)回顧一、前言百草枯中毒后會引起患者肺部出現(xiàn)炎性細(xì)胞的浸潤,并發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)。百草枯中毒后的免疫機(jī)制激活可能是重要的致病機(jī)制之一。但是具體有哪些炎性細(xì)胞可以浸潤到肺組織內(nèi)目前缺乏相應(yīng)的研究。我們對一例死亡的百草枯患者的肺組織進(jìn)行了 MPO,CD4,CD8,CD21,CD56,CD68,CD79,SMA免疫組化的染色,來明確浸潤細(xì)胞的類型。為證明免疫激活在百草枯中毒中的作用提供病理學(xué)依據(jù)。二、方法和材料材料倫理學(xué):尸體解剖的取樣和分析經(jīng)家屬同意,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。符合現(xiàn)行的中國法律,遵循赫爾辛基宣言的道德規(guī)范。病例報告和尸體解剖:2014年12月,患者,石某某,女,38歲,因“口服百草枯100毫升4小時”入院,一周后死亡。尸體保存在2-3攝氏度尸體箱內(nèi),于死后的第三天進(jìn)行解剖。留取心、肺、腎標(biāo)本。為進(jìn)一步明確百草枯中毒后免疫細(xì)胞的浸潤情況,2016-08我們對死者的肺部組織蠟塊再次切片,進(jìn)行HE染色和應(yīng)用MPO,CD4,CD8,CD21,CD56,CD68,CD79,SMA 免疫組化分析。三、實驗結(jié)果3.1肺部HE染色HE染色下的肺組織呈現(xiàn)典型的ARDS樣改變,包括炎性細(xì)胞浸潤、彌漫性肺泡損傷(diffuse alveolar damage,DAD)、透明膜形成和纖維化。相對于正常的肺組織(圖7),鏡下可見肺部組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺實變明顯,炎性細(xì)胞(以中性粒細(xì)胞為主)廣泛的浸潤到肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)(圖1,圖2)�？梢姷椒谓M織的灶性壞死,壞死灶內(nèi)的正常結(jié)構(gòu)消失,充填大量炎性細(xì)胞(以中性粒細(xì)胞為主)、紅細(xì)胞、纖維蛋白沉積(圖3,圖4)。部分肺組織呈現(xiàn)纖維化樣表現(xiàn)(圖5),鏡下見到胞核較大,核仁明顯,胞質(zhì)豐富的成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞周邊纖維增生,炎性細(xì)胞浸潤。肺泡塌陷,大量的肺泡內(nèi)有明顯出血,肺泡內(nèi)充滿漿性滲液,并含有大量纖維素,有肺泡上皮細(xì)胞的脫落和大量炎性細(xì)胞的浸潤。肺泡表面可見到明顯的透明膜形成(圖6)。肺間質(zhì)水腫,肺泡壁增厚,肺泡旁毛血管明顯充血、擴(kuò)張。3.2中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞是在肺內(nèi)浸潤最多的炎性細(xì)胞。鏡下可見大量胞質(zhì)深染的MPO陽性中性粒細(xì)胞浸潤到肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)(圖8)。在血管旁的密度較大,可見到部分中性粒細(xì)胞正在穿過血管壁(圖9)。3.3單核/巨噬細(xì)胞單核/巨噬細(xì)胞是在肺內(nèi)浸潤的數(shù)量僅次于中性粒細(xì)胞。鏡下可見肺組織內(nèi)有大量的CD68陽性的巨噬細(xì)胞分布(圖10)。在出血壞死灶內(nèi)的巨噬細(xì)胞明顯增多,染色不均一,染色深的考慮是已經(jīng)吞噬粉塵和組織碎片的巨噬細(xì)胞,染色較淺的考慮是新招募的還未吞噬顆粒的單核巨噬細(xì)胞(圖 11)。3.4輔助T細(xì)胞CD4陽性的T細(xì)胞為Th細(xì)胞,在鏡下也明顯增多(圖12),這些胞膜深染的Th細(xì)胞多聚集在一起,分布在出血灶內(nèi)(圖13),肺間質(zhì)內(nèi)(圖14)。3.5殺傷T細(xì)胞殺傷T細(xì)胞的免疫組化CD8呈陽性反應(yīng),在鏡下也明顯增多(圖15),這些胞膜深染的殺傷性T細(xì)胞多聚集在一起,分布在出血灶內(nèi)(圖16),肺間質(zhì)內(nèi)(圖17)。3.6 NK細(xì)胞CD56是NK細(xì)胞表面表達(dá)的標(biāo)識分子。NK細(xì)胞數(shù)量較少。鏡下可見胞膜深染的NK細(xì)胞散在分布在肺間質(zhì)內(nèi)(圖18,圖19)。3.7 CD21陽性和CD79陽性的B細(xì)胞鏡下可見CD21(圖20)和CD79(圖21,圖22)陽性的B細(xì)胞胞膜深染,主要分布在血管內(nèi)部。肺間質(zhì)內(nèi)很少出現(xiàn)。3.8成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞SMA是平滑肌的α的肌動蛋白,可以分布在血管平滑肌和肌成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),在該患者的免疫組化中發(fā)現(xiàn),SMA高表達(dá),廣泛分布在肺血管和肺間質(zhì)內(nèi)(圖23,圖25),并出現(xiàn)泛染的跡象。我們在肺泡毛細(xì)血管和肺泡上皮細(xì)胞(圖24)中也發(fā)現(xiàn)存在SMA的高表達(dá),在這些區(qū)域SMA在這些區(qū)域通常不會表達(dá)。四、結(jié)論通過HE和免疫組化染色,該患者的肺部存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),固有免疫和適應(yīng)性免疫都參與到了這種嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)中。在固有免疫中以中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的浸潤為主。在適應(yīng)性免疫中Th細(xì)胞和細(xì)胞毒性的T細(xì)胞增多的明顯。SMA的免疫組化顯示患者肺部間質(zhì)、肺泡上皮細(xì)胞和肺泡毛細(xì)血管的上皮細(xì)胞中存在高表達(dá),為早期纖維化的傾向。第二部分實驗一:DAMPs、無菌性炎癥通路、中性粒細(xì)胞參與百草枯中毒介導(dǎo)的肺損傷一、前言百草枯中毒是臨床上較為棘手的一種中毒性疾病。目前的治療方法沒有從總體上改善患者的病死率。研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒后免疫系統(tǒng)主動參與了病情的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸,我們的尸體解剖報告和初步動物試驗證實固有免疫在百草枯中毒中可能起到重要作用。百草枯中毒的免疫致病機(jī)制實質(zhì)上可能是DAMPs觸發(fā)的無菌性炎癥。但是目前沒有相關(guān)研究。對百草枯中毒后免疫反應(yīng)的始動環(huán)節(jié)(DAMPs釋放)、炎性通路的激活、炎性效應(yīng)細(xì)胞和肺損傷的關(guān)系的研究具有一定創(chuàng)新性�；谝陨侠碛晌覀冊诒狙芯恐刑岢鲆韵录僬f:百草枯中毒后大量的ROS產(chǎn)生后,各種細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的破壞,使得細(xì)胞壞死,釋放出大量的DAMPs,DAMPs作用于細(xì)胞上的PPR,激活無菌性的炎性通路(以TLR4為代表的胞膜途徑,以NLRP3為代表的胞內(nèi)途徑),產(chǎn)生一系列的炎性因子和趨化因子招募中性粒細(xì)胞為代表的炎性細(xì)胞到達(dá)損傷部位,從而產(chǎn)生無菌性炎癥。二、試驗方法將36只SD大鼠隨機(jī)分為3組,輕度組(百草枯25mg/Kg腹腔注射)、重度組(百草枯50mg/Kg腹腔注射)和空白組(生理鹽水2ml腹腔注射),每組12只。在腹腔注射百草枯后第12.24.72h分別取出4只,麻醉后處死,收集左肺的肺泡灌洗液,右肺組織,血液。生化儀檢測左肺的肺泡灌洗液和血清中尿酸(DAMP),左肺的肺泡灌洗液和血清中促炎因子(IL-1β,IL-18,TNF-α,TGFβ1)。提取右肺上葉 RNA,qPCR 檢測 TLR4、myD88、NF-κB、mtDNA(ND2,DAMP)、NLRLP3、ASC、capase-1、mRNA 表達(dá)情況。提取部分右肺中葉蛋白Western Blot檢測TLR4、myD88、ASC、capase-1、NF-κB蛋白表達(dá)情況。右肺中葉部分肺組織進(jìn)行ROS檢測。右肺下葉部分組織包埋切片,HE染色進(jìn)行組織學(xué)肺損傷評分。(染色+拍照+評分),免疫組織化學(xué)方法檢測中性粒細(xì)胞(MPO)、HMGB1(DAMP)。(n=3)右肺下葉部分組織無水乙醇固定、包埋、切片。Gomori六胺銀溶液染色觀察尿酸。三、實驗結(jié)果3.1百草枯中毒導(dǎo)致DAMPs的釋放。3.1.1 HMGB1結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致HMGB1的升高。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的HMGB1明顯升高(除24小時輕度組,與對照組比較有上升趨勢,無統(tǒng)計學(xué)意義),P0.05,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.1.2尿酸發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致尿酸的升高。六胺銀染色中的尿酸成棕黑色,隨著劑量和和時間的增大,棕黑色的面積和深度明顯增強。在血清和肺泡灌洗液的生化檢測中,相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的尿酸均明顯升高,P0.01,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.1.3mtDNA結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致mtDNA的升高。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的mtDNA明顯升高,P0.001,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.2TLR4途徑的激活3.2.1 TLR4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)3.2.1.1 TLR4 的轉(zhuǎn)錄結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致TLR4的轉(zhuǎn)錄增強。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的TLR4明顯升高,P0.01,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.2.1.1 TLR4 的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致TLR4的表達(dá)增強。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的TLR4有升高(12小時和24小時有統(tǒng)計學(xué)差異,P0.001,72小時的無明顯統(tǒng)計學(xué)差異),且隨著時間的延長成升高趨勢。3.2.2MyD88的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致MyD88的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增強。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的MyD88明顯升高,P0.05,除在72小時輕度組MyD88的表達(dá)升高無統(tǒng)計學(xué)意義。3.2.3 NF-κ B的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致NF-κB的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增強。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的NF-κB明顯升高,P0.01,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.3NLRP3途徑的激活3.3.1 NLRP3 的轉(zhuǎn)錄結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致NLRP3的轉(zhuǎn)錄增強。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的NLRP3明顯升高,P0.001,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.3.2 ASC的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致ASC的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增強。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的ASC明顯升高,P0.01,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.3.3 Caspase-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致Caspase-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增強。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的Caspase-1明顯升高,P0.001,且隨著時間的延長成升高趨勢3.4 IL-1β和IL-18的分泌結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致Il-1β、11-18的水平升高。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的I1-1β、11-18明顯升高,P0.05,(除血清中的Il-1β在輕度中毒組12和24小時有升高趨勢,無統(tǒng)計學(xué)意義),且隨著時間的延長成升高趨勢。3.5其他細(xì)胞因子的分泌結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致TNF-α、TGFβ1的水平升高。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的TNF-α、TGFβ1明顯升高,P0.05,(除血清中的TNF-α,在輕度組24小時有升高趨勢無統(tǒng)計學(xué)意義),且隨著時間的延長成升高趨勢。3.6中性粒細(xì)胞的計數(shù)及功能3.6.1中性粒細(xì)胞在MPO肺內(nèi)免疫組化染色及計數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的在肺內(nèi)增加。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯升高,P0.05,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.6.2 R0S結(jié)果發(fā)現(xiàn):百草枯可以導(dǎo)致ROS的在肺內(nèi)增加。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的ROS水平明顯升高,P0.01,且一直維持在較高的水平,未見明顯的波動。3.7肺病理評分結(jié)果發(fā)現(xiàn):大體觀察:con的肺組織大小重量正常,肺組織呈粉紅色,彈性良好。輕度組和重度組的肺組織均出現(xiàn)明顯腫脹,重量增加。肺組織色澤較暗,質(zhì)地較硬,有明顯的出血灶,出血的范圍隨著時間和劑量對的加大明顯加重。由于時間較短,未觀察到明顯的纖維化征象。HE染色:con正常;輕度組與重度組表現(xiàn)出不同程度的肺充血,水腫,炎性細(xì)胞浸潤,纖維化(72小時候明顯)。百草枯可以導(dǎo)致肺損傷增加。相對于對照組,各時間點的不同劑量染毒組的肺損傷評分明顯升高,P0.01,且隨著時間的延長成升高趨勢。3.8肺部浸潤的中性粒細(xì)胞和肺損傷之間相關(guān)性性我們采用直線相關(guān)分析72小時段MPO和肺損傷評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn):MPO與肺損傷評分成正相關(guān),r=0.908,P0.01。四、結(jié)論百草枯中毒早期(72小時內(nèi)),大量的ROS產(chǎn)生后,釋放出大量的DAMPs(HMGB1,尿酸,mtDNA),DAMPs作用于細(xì)胞上的PPR,激活無菌性的炎性通路(以TLR4-MyD88-NFκB為代表的胞膜途徑,以NLRP3炎性小體為代表的胞內(nèi)途徑),產(chǎn)生了炎性因子IL-1β和IIL-18,招募以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞在肺部浸潤增加,產(chǎn)生無菌性炎癥造成肺損傷。百草枯引發(fā)的炎癥還使得TNF-α、TGFβ1的產(chǎn)生增多。在百草枯中毒的早期,炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度(IL-1β、IL-18、TNF-α、TGFβ1和肺損傷評分)和百草枯在一定程度上成時間和劑量成正相關(guān)趨勢。72小時段,肺部中性粒細(xì)胞的數(shù)量和肺損傷評分成正相關(guān)。第三部分實驗二從無菌性炎癥的角度研究環(huán)磷酰胺對百草枯中毒治療作用的機(jī)制一、前言我們在實驗一中證明了百草枯導(dǎo)致無菌性炎癥中,中性粒細(xì)胞起到重要作用。DAMPs招募中性粒細(xì)胞的正反饋效應(yīng)可能是百草枯中毒過度的無菌性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。環(huán)磷酰胺是治療百草枯的基礎(chǔ)藥物。早在1986年E.A DDO就闡述了了利用環(huán)磷酰胺治療百草枯中毒的理由:環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑可以有效地減少中性粒細(xì)胞,減輕炎癥反應(yīng),可能對后期的纖維化有一定的治療效果。后期的臨床研究也發(fā)現(xiàn)患者血常規(guī)中的白細(xì)胞計數(shù)可以作為百草枯中毒的預(yù)后指標(biāo)。是否可以從抑制無菌性炎癥的角度,來闡述環(huán)磷酰胺的治療百草枯中毒的機(jī)制,目前沒有相關(guān)的研究。我們從無菌性炎癥的角度來驗證E.A DDO等人提出的假說:中性粒細(xì)胞在百草枯中毒介導(dǎo)的肺損傷中起到重要作用。中性粒細(xì)胞缺乏可能減輕百草枯造成的肺損傷。本研究使用環(huán)磷酰胺預(yù)處理大鼠,造成粒細(xì)胞減少的免疫抑制模型,研究環(huán)磷酰胺與無菌性炎癥的關(guān)系,比較干預(yù)組的大鼠和正常染毒組的大鼠之間炎癥通路激活和肺部炎癥發(fā)生的差異性。二、方法和材料根據(jù)預(yù)實驗及實驗一結(jié)果,將48只SD大鼠隨機(jī)分為4組,重度染毒組(百草枯50mg/Kg腹腔注射)、干預(yù)組(環(huán)磷酰胺+染毒組,實驗前48、24h,100mg/kg環(huán)磷酰胺腹膜內(nèi)注射,百草枯50mg/Kg腹腔注射)、空白對照組(生理鹽水2ml腹腔注射),免疫抑制組(實驗前48、24h,100mg/kg環(huán)磷酰胺腹膜內(nèi)注射),每組12只。在腹腔注射百草枯后第12.24.72h分別取出4只,麻醉后處死,收集左肺的肺泡灌洗液,右肺組織,血液。生化儀檢測左肺的肺泡灌洗液和血清中尿酸(DAMP),左肺的肺泡灌洗液和血清中促炎因子(IL-1β,IL-18,TNF-α,TGFβ1)。提取右肺上葉 RNA,qPCR 檢測 TLR4、myD88、NF-κB、mtDNA(ND2,DAMP)、NLRLP3、ASC、capase-1、mRNA 表達(dá)情況。提取部分右肺中葉蛋白Western Blot檢測TLR4、myD88、ASC、capase-1、NF-κB蛋白表達(dá)情況。右肺中葉部分肺組織進(jìn)行ROS檢測。右肺下葉部分組織包埋切片,HE染色進(jìn)行組織學(xué)肺損傷評分。(染色+拍照+評分),免疫組織化學(xué)方法檢測中性粒細(xì)胞(MPO)、HMGB1(DAMP),n=3。右肺下葉部分組織無水乙醇固定、包埋、切片。Gomori六胺銀溶液染色觀察尿酸(染色+拍照)。三、結(jié)果3.1環(huán)磷酰胺對百草枯中毒介導(dǎo)的DAMPs釋放的影響3.1.1 HMGB1免疫組化染色:深染的HMGB1的細(xì)胞在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組中均明顯增多,其中染毒組和干預(yù)組的增多最為明顯。定量分析:相對于對照組,HMBG1陽性的細(xì)胞數(shù)在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組中均明顯升高。與染毒組相比較,干預(yù)組在24小時明顯高于染毒組,P0.05,其余未見明顯差異。3.1.2尿酸六胺銀染色的肺組織:六胺銀染色中的尿酸成棕黑色,相對于對照組,染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組棕黑色的面積和深度明顯增強,以干預(yù)組最為明顯。生化儀監(jiān)測尿酸水平:在血清和肺泡灌洗液中的表現(xiàn)較為一致。相對于對照組,HMBG1染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,其中干預(yù)組升高最為明顯,P0.001。與染毒組相比較,干預(yù)組的尿酸明顯高于染毒組,P0.001。各時間點趨勢基本相同。3.1.3mtDNA相對于對照組,各時間段的mtDNA在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低,P0.001。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組的mtDNA明顯小于染毒組,P0.01。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。3.2環(huán)磷酰胺對百草枯中毒介導(dǎo)的TLR4途徑激活的影響3.2.1 TLR4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)3.2.1.1 TLR4 的轉(zhuǎn)錄相對于對照組,各時間段TLR4的轉(zhuǎn)錄在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.01,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組的TLR4轉(zhuǎn)錄明顯小于染毒組,P0.01,除24小時無統(tǒng)計學(xué)意義。各時間點趨勢基本相同。3.2.1.2 TLR4 的表達(dá)相對于對照組,各時間段TLR4的表達(dá)在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.05(除72小時,僅環(huán)磷酰胺組有統(tǒng)計學(xué)差異,干預(yù)組和染毒組有升高趨勢,無統(tǒng)計學(xué)差異),其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組的TLR4表達(dá)明顯小于染毒組,P0.001(除72小時的無統(tǒng)計學(xué)差異)。3.2.2MyD88的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)3.2.2.1 MyD88 的轉(zhuǎn)錄相對于對照組,各時間段MyD88的轉(zhuǎn)錄在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低,P0.01,除12小時干預(yù)組有升高趨勢,無統(tǒng)計學(xué)意義。與染毒組相比較,干預(yù)組的MyD88轉(zhuǎn)錄明顯小于染毒組,P0.05。各時間點趨勢基本相同。3.2.2.2 MyD88 的表達(dá)相對于對照組,各時間段MyD88的表達(dá)在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.05,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。與染毒組相比較,干預(yù)組的MyD88表達(dá)小于染毒組,12小時和24小時有統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05,72小時無統(tǒng)計學(xué)差異。3.2.3 NF-κ B的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)3.2.3.1 NF-κB 的轉(zhuǎn)錄相對于對照組,各時間段NF-κB的轉(zhuǎn)錄在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.01,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組的NF-κB轉(zhuǎn)錄均明顯小于染毒組,P0.001。3.2.3.2 NF-κ B 的表達(dá)相對于對照組,各時間段NF-κB的表達(dá)在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.01,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。與染毒組相比較,干預(yù)組的NF-κB表達(dá)明顯小于染毒組,P0.001。3.3環(huán)磷酰胺對百草枯中毒介導(dǎo)的NLRP3途徑激活的影響3.3.1 NLRP3 的轉(zhuǎn)錄相對于對照組,各時間段NLRP3的轉(zhuǎn)錄在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低,P0.001。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組的NLRP3轉(zhuǎn)錄明顯小于染毒組,P0.001(72小時無顯著統(tǒng)計學(xué)差異)。3.3.2ASC的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)3.3.2.1 ASC 的轉(zhuǎn)錄相對于對照組,各時間段ASC的轉(zhuǎn)錄在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.001,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組的ASC轉(zhuǎn)錄均明顯小于染毒組,P0.01。3.3.2.2 ASC 的表達(dá)相對于對照組,各時間段ASC的表達(dá)在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.01,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。與染毒組相比較,干預(yù)組的ASC表達(dá)明顯小于染毒組,P0.001。3.3.3 Caspase-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)3.3.3.1 Caspase1 的轉(zhuǎn)錄相對于對照組,各時間段Caspase1的轉(zhuǎn)錄在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.001,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。且隨時間的延長各組有增高的趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組的Caspase1轉(zhuǎn)錄明顯小于染毒組,P0.001。3.3.3.2 Caspase-1 的表達(dá)彩圖見3.2環(huán)磷酰胺對百草枯介導(dǎo)相關(guān)炎性通路蛋白表達(dá)的影響,WB定量見圖 3.3.3.2結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對于對照組,各時間段Caspase-1的表達(dá)在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.001,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。與染毒組相比較,干預(yù)組的Caspase-1表達(dá)均小于染毒組,12小時和24小時無統(tǒng)計學(xué)差異,72小時的下降有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。各時間點趨勢基本相同。3.4 環(huán)磷酰胺對百草枯中毒介導(dǎo)的炎性通路下游炎性因子(IL-1β和IL-18)的影響3.4.1 I L-1 β血液中的Il-1β相對于對照組,各時間段I1-1β的水平在染毒組明顯升高,P0.01;干預(yù)組在12小時和24小時高于對照組,在72小時低于對照組,但均無統(tǒng)計學(xué)差異。環(huán)磷酰胺組在12小時和24小時低于對照組,但無統(tǒng)計學(xué)差異,72小時明顯降低,有統(tǒng)計學(xué)差異。與染毒組相比較,在各時間段,干預(yù)組的I1-1β水平均明顯小于染毒組,P0.01。肺泡灌洗液中的Il-1β相對于對照組,各時間段Il-1β的水平在染毒組明顯升高,P0.01;干預(yù)組和對照組無明顯差異;環(huán)磷酰胺組各時間段Il-1β的水平均明顯降低,P0.05。與染毒組相比較,在各時間段,干預(yù)組的I1-1β表達(dá)明顯小于染毒組,P0.001。3.4.2 IL-18血清中的IL-18相對于對照組,各時間段11-18的水平在染毒組、干預(yù)組明顯升高,P0.01;環(huán)磷酰胺組在24小時明顯降低,12小時和72小時有升高趨勢,無統(tǒng)計學(xué)差異與染毒組相比較,在各時間段,干預(yù)組的11-18水平均明顯小于染毒組,P0.001。肺泡灌洗液中的IL-18相對于對照組,各時間段11-18的水平在染毒組均明顯升高P0.05;干預(yù)組在12小時低于對照組,無統(tǒng)計學(xué)差異,在24、72小時干預(yù)組明顯高于對照組P0.01;環(huán)磷酰胺組均小于對照組,僅12小時的降低有統(tǒng)計學(xué)差異P0.05。與染毒組相比較,在各時間段,干預(yù)組的I1-18水平均明顯小于染毒組P0.001。3.5環(huán)磷酰胺對百草枯中毒介導(dǎo)的其他細(xì)胞因子(TNF-α和TGFβ)的影響TNF-α為了確定環(huán)磷酰胺對百草枯中毒介導(dǎo)的TNF-α的影響,我們對血液和肺泡灌洗液中的TNF-α進(jìn)行了 ELISA檢測。血清中的TNF-α相對于對照組,各時間段TNF-α的水平在染毒組明顯升高,P0.05;干預(yù)組較對照組有升高趨勢,僅72小時有統(tǒng)計學(xué)差異,P0.01,12、24小時無統(tǒng)計學(xué)差異,環(huán)磷酰胺組在12小時升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異,24小時和72小基本持平,無統(tǒng)計學(xué)差異。與染毒組相比較,在12小時和24小時時間段,干預(yù)組的TNF-α水平明顯小于染毒組,P0.01。72小時后,TNF-α水平高于染毒組,無統(tǒng)計學(xué)差異。肺泡灌洗液中的TNF-α相對于對照組,各時間段TNF-α的水平在染毒組、干預(yù)組明顯升高,P0.01;環(huán)磷酰胺組均略低于對照組,無統(tǒng)計學(xué)差異。與染毒組相比較,在各時間段,干預(yù)組的TNF-α水平均明顯小于染毒組,P0.01。TGFβ血清中的TGFβ相對于對照組,各時間段TGFβ的水平在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組明顯升高,P0.05。其中染毒組最高,干預(yù)組次之,環(huán)磷酰胺組最低。與染毒組相比較,各時間段,干預(yù)組的TGFβ水平均明顯小于染毒組,P0.001。肺泡灌洗液中的TGFβ相對于對照組,各時間段TGFβ的水平在染毒組、干預(yù)組明顯升高,P0.001;環(huán)磷酰胺組趨勢不明顯。與染毒組相比較,各時間段,干預(yù)組的TGFβ水平明顯小于染毒組,P0.01。3.6環(huán)磷酰胺對百草枯中毒介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的計數(shù)及功能的影響3.6.1中性粒細(xì)胞在MPO肺內(nèi)免疫組化染色及計數(shù)免疫組化:深染的MPO陽性的細(xì)胞在染毒組、干預(yù)組中明顯增多,環(huán)磷酰胺組相對于其他各組有減少。定量分析:相對于對照組,各時間段MPO陽性的細(xì)胞數(shù)的比例的水平在染毒組、干預(yù)組明顯升高,P0.05;環(huán)磷酰胺組在12小時、24小時明顯低于對照組,P0.01,在72小時高于對照組,但無統(tǒng)計學(xué)差異。與染毒組相比較,在干預(yù)組在各時間段的MPO均明顯低于染毒組,P0.05。3.6.2 ROS相對于對照組,各時間段的ROS在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.001,其中以環(huán)磷酰胺組最高,染毒組次之,干預(yù)組最低。與染毒組相比較,干預(yù)組各時段的ROS小于染毒組,但僅有72小時有統(tǒng)計學(xué)差異P0.01。3.7肺病理評分大體觀察:con組的肺組織大小重量正常,肺組織呈粉紅色,彈性良好。環(huán)磷酰胺組的肺組織較為蒼白,彈性差。部分肺組織出現(xiàn)出血灶。染毒組和干預(yù)組的肺組織均出現(xiàn)明顯腫脹,重量增加。肺組織色澤較暗,質(zhì)地較硬,有明顯的出血灶,出血的范圍隨著時間延長有加重趨勢。與染毒組相比較,干預(yù)組肺組織的充血范圍并不均一,存在較為正常的肺組織,殘存相對正常的肺組織范圍隨時間也逐漸縮小。由于時間較短,未觀察到明顯的纖維化征象。HE染色:con正常;染毒組和干預(yù)組表現(xiàn)出不同程度的肺充血,水腫,炎性細(xì)胞浸潤,纖維化(72小時候明顯)。與染毒組相比較干預(yù)組的炎癥表現(xiàn)相對較輕。環(huán)磷酰胺組有出血表現(xiàn),相對于其他各組,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。肺損傷評分:相對于對照組,各時間段的肺損傷評分在染毒組、干預(yù)組、環(huán)磷酰胺組都明顯升高,P0.05,(除12小時環(huán)磷酰胺組,無統(tǒng)計學(xué)差異)其中以染毒組最高,干預(yù)組次之,環(huán)磷酰胺組最低。與染毒組相比較,干預(yù)組的肺損傷評分明顯小于染毒組,P0.05。3.8在環(huán)磷酰胺作用下,肺部浸潤的中性粒細(xì)胞和肺損傷之間相關(guān)性性MPO與肺損傷評分成正相關(guān),r=0.969,P0.01。見圖3.8四、結(jié)論環(huán)磷酰胺預(yù)干預(yù)后,在百草枯中毒早期(72小時內(nèi)),可以減少中性粒細(xì)胞浸潤,減輕肺損傷。72小時段,肺部浸潤的中性粒細(xì)胞與肺損傷評分成正相關(guān)。環(huán)磷酰胺并不是治療百草枯中毒非常理想的藥物。相對于對照組,它本身增加ROS、DAMPs的釋放及無菌性的炎性通路的激活(以TLR4-MyD88-NF-κB為代表的胞膜途徑,以NLRP3-ASC-Caspase1為代表的胞內(nèi)途徑),但并不增加下游的炎性因子IL-1β和IL-18(部分呈下降趨勢),不增加TNF-α的分泌,可增加TGFβ1的產(chǎn)生。在環(huán)磷酰胺干預(yù)后百草枯中毒的大鼠中,相對于染毒組,雖然不減少DAMPs的釋放,但可以減輕ROS的釋放(72小時有意義),減輕無菌性的炎性通路的激活,以及下游產(chǎn)生炎性因子IL-1β和IL-18。TNF-α、TGFβ1的產(chǎn)生也相應(yīng)減少。其機(jī)制除了減少中性粒細(xì)胞外,還可能和環(huán)磷酰胺干擾DNA功能,NF-κB無法幫助下游炎癥因子翻譯順利進(jìn)行等機(jī)制有關(guān)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R595.4;R563.1
【部分圖文】：

圖３肺組織實變，存在灶性壞死，壞死灶內(nèi)可見大量粒細(xì)胞浸潤

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑圖４壞死灶內(nèi)的粒細(xì)胞浸潤情況。壞死灶內(nèi)的正常結(jié)構(gòu)消失，充填大量炎性細(xì)逡逑胞（以中性粒細(xì)胞為主）、紅細(xì)胞、纖維蛋白沉積。４００倍逡逑

圖７用于對比的正常人肺組織逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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2 簡宇;黃宏;簡華剛;;內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化在纖維化疾病中作用的研究進(jìn)展[J];感染、炎癥、修復(fù);2010年03期

3 賀曉艷;孫琦;李忠旺;盧中秋;洪廣亮;梁歡;邱俏檬;胡國新;;急性百草枯中毒大鼠肺組織炎癥因子表達(dá)的變化及意義[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2009年03期

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本文編號：2831085