目的:研究在2型糖尿病(dbdb)小鼠模型中,骨髓高表達神經(jīng)營養(yǎng)因子neuritin對外周神經(jīng)病變的影響及其作用機制。方法:1.構建骨髓特異性高表達neuritin的轉基因小鼠,用構建的高表達neuritin與db/m雜合子雜交獲得高表達neuritin的2型糖尿病小鼠;將實驗分為8組:(1)正常對照組(db/m)小鼠(2)2型糖尿病組(TD2)小鼠(3)2型糖尿病+二甲雙胍組(TD2+MET)小鼠(4)高表達neuritin+2型糖尿病組(A/Lyz-Cre+TD2)小鼠(5)高表達neuritin+2型糖尿病+二甲雙胍組(A/Lyz-Cre+TD2+MET)小鼠(6)高表達neuritin+db/m小鼠組(A/Lyz-Cre+db/m)小鼠,從第10周鼠齡開始喂藥,連續(xù)給藥8周,每周測1次體重,每兩周測1次空腹血糖。2.喂藥結束后,對各組小鼠進行神經(jīng)傳導檢測,觀察小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量;用ELISA對各組小鼠骨髓上清、血漿、坐骨神經(jīng)上清的SDF-1進行檢測。3.用HE和油紅O染色,檢測各組小鼠骨髓病理結構和脂肪堆積;用激光共聚焦結合免疫熒光組織化學檢測各組小鼠骨髓神經(jīng)密度(TH)、微血管密度(CD31)、骨髓neuritin的表達。4.用透射電鏡檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)病理的結構,用激光共聚焦結合免疫熒光組織化學檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)的神經(jīng)元再生(GAP43)、神經(jīng)纖維密度(NF200)、神經(jīng)髓鞘化(GFAP)、雪旺細胞的增殖(S100+Brdu)。5.采用骨髓提原代BMSC進行體外遷移實驗,檢測SDF-1α,AMD3100(CXCR4抑制劑)、Ly294002(Pakt抑制劑)對BMSC遷移的影響,以及觀察2型糖尿病狀和2型糖尿病骨髓高表達neuritin狀態(tài)下BMSC遷移的變化;用激光共聚焦結合免疫熒光組織化學檢測骨髓CXCR4、SDF-1α的表達以及坐骨神經(jīng)Pakt的表達。結果:1.TD2小鼠的MNCV和SNCV顯著低于db/m小鼠(P0.05),治療組小鼠(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠、TD2+MET小鼠)的MNCV和SNCV有明顯改善(P0.05)。2.治療組小鼠在經(jīng)過8周研究治療時出現(xiàn)血糖進展減緩,喂藥結束后血糖顯著低于TD2小鼠(P0.05);且相較于TD2小鼠,2型糖尿病骨髓高表達neuritin模型(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)的體重明顯減輕(P0.05),而TD2+MET小鼠體重無明顯變化;治療組小鼠的血清TC、LDL-C含量低于TD2小鼠但不具有統(tǒng)計意義(P0.05),而它們的TG含量低于TD2小鼠且差異顯著(P0.05);對于HDL-C,2型糖尿病骨髓高表達neuritin模型顯著高于TD2小鼠(P0.05),而TD2+MET小鼠只略高于TD2小鼠但不具有統(tǒng)計意義(P0.05)。3.股骨HE染色表明:相較于TD2小鼠,治療組小鼠的細胞密度明顯改善,且均低于db/m小鼠和A/Lyz-Cre+db/m小鼠(P0.05);油紅O染色表明:治療組小鼠的油紅O陽性率與TD2小鼠相比無顯著差異(P0.05),且均顯著高于db/m小鼠和A/Lyz-Cre+db/m小鼠(P0.05);4.股骨免疫熒光染色表明:與db/m小鼠、A/Lyz-Cre+db/m小鼠相比,TD2小鼠骨髓CD31陽性面積和骨髓TH陽性率大大降低(P_(CD31)0.001,P_(TH)0.05),而治療組相較于TD2小鼠,其骨髓CD31陽性面積和骨髓TH陽性率有明顯提高(P_(CD31)0.05,P_(TH)0.05)。5.在透射電鏡下TD2小鼠的坐骨神經(jīng)表現(xiàn)為線粒體脊消失、線粒體外膜腫脹、神經(jīng)軸索膜與髓鞘膜分離、髓鞘板層結構消失的癥狀,MET治療后其病理癥狀有輕微程度減輕,而2型糖尿病骨髓高表達neuritin模型的以上癥狀有明顯改善;坐骨神經(jīng)免疫熒光染色表明:TD2小鼠、TD2+MET小鼠的坐骨神經(jīng)GAP43表達量顯著低于骨髓高表達neuritin模型(A/Lyz-Cre+db/m小鼠、A/Lyz-Cre+TD2小鼠和A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)(P0.01);TD2小鼠相較于db/m小鼠、A/Lyz-Cre+db/m小鼠坐骨神經(jīng)施旺細胞的增殖速率(Brdu+S100)顯著降低(P0.05),2型糖尿病骨髓高表達neuritin模型相較于TD2小鼠坐骨神經(jīng)施旺細胞的增殖速率明顯改善(P0.01);TD2小鼠、TD2+MET小鼠坐骨神經(jīng)GFAP分布區(qū)域遠低于db/m小鼠(P0.05),2型糖尿病骨髓高表達neuritin模型比TD2小鼠坐骨神經(jīng)GFAP分布顯著增多(P0.01)。而各模型鼠間坐骨神經(jīng)NF200表達量無顯著性差異。6.BMSC體外遷移結果顯示:SDF-1α確實能夠增強BMSC的遷移,并且是沿著SDF-1α濃度梯度方向遷移的,當用CXCR4抑制劑(AMD3100)和Pakt抑制劑(Ly94002)處理后,BMSC的遷移能力顯著降低;TD2小鼠的BMSC遷移率顯著低于db/m小鼠,而在2型糖尿病狀態(tài)下骨髓高表達neuritin有助于BMSC的遷移;ELISA實驗結果顯示:2型糖尿病狀態(tài)下坐骨神經(jīng)的SDF-1α濃度明顯增高,而在骨髓高表達neuritin的模型鼠中(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)SDF-1α濃度按骨髓-血漿-坐骨神經(jīng)梯度分布率更明顯;通過股骨切片的SDF-1α+CXCR4免疫熒光染色顯示:在2型糖尿病狀態(tài)下(包括2型糖尿病骨髓高表達neuritin的模型鼠)小鼠骨髓的SDF-1α與CXCR4有共定位;通過坐骨神經(jīng)切片的GFAP+Pakt免疫熒光染色顯示:2型糖尿病狀態(tài)下小鼠坐骨神經(jīng)髓鞘受到損傷會激活Pakt,而骨髓高表達neuritin也會促進Pakt的激活。結論:1.骨髓神經(jīng)neuritin能修復2型糖尿病骨髓神經(jīng)病變,改善骨髓功能。2.骨髓神經(jīng)neuritin能提高骨髓間充質干細胞的遷移能力。3.骨髓神經(jīng)neuritin修復2型糖尿病外周神經(jīng)病變是通過SDF-1α/CXCR4軸激活PI3K/Akt通路來實現(xiàn)的,推測骨髓間充質干細胞參與其中發(fā)揮著重要的修復作用。
【學位單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文46圖4 各組小鼠骨髓細胞密度和脂肪體積比較。（A）各組小鼠股骨HE染色（100×）左圖顯示典型區(qū)域放大（400×）； （B）各組小鼠股骨油紅O染色（400×）（C）對各組小鼠股骨細胞密度的定量分析；（D）對各組小鼠股骨油紅O陽性區(qū)域面積的定量分析；與正常組相比**P <0.01，與2型糖尿病組相比##P <0.05。Figure 4 The comparison of bone marrow cell density and fat volume of mouse in eachgroup. (A)The femur HE staining (100 ×), the left shows the typical area magnification (400×). (B) The femur with oil red O staining (400 ×). (C) Quantitative of cell density of femur.(D) Quantitative of positive area of the femur with oil red O .**P <0.01vs control group,##P<0.05 vs type 2 diabetes group.5.2 小鼠骨髓微血管病變 與正常對照db/m小鼠組和高表達neuritin+db/m小鼠組相比，2型糖尿病組小鼠骨髓CD31陽性面積大大降低，即累積的血管密度顯著性減少（P<0.001）；對于治療組（高表達neuritin+2型糖尿病組、高表達neuritin+2型糖尿病+二甲雙胍、2型糖尿病+二甲雙胍組），骨髓CD31陽性面積有明顯提高，提示其骨髓的血管密度大于2型糖尿�。≒<0.05）(見圖5A，5B)。5.3 小鼠骨髓交感神經(jīng)病變 用交感神經(jīng)纖維抗體：兒茶酚胺酶酪氨酸羥化酶（TH）染色骨髓，來評估各組小鼠交感神經(jīng)病變情況。與正常對照db/m

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文48圖5 各組模型鼠骨髓微血管病變程度和交感神經(jīng)病變程度的比較。（A）激光共聚焦IF圖片顯示各組小鼠股骨的CD31（紅）、TH（綠）、核（DAPI）染色率，比列尺：50mm；（B）對各組小鼠股骨CD31陽性區(qū)域的定量分析；（C）對各組小鼠股骨TH陽性的區(qū)域定量分析；與正常組相比**P <0.01，與2型糖尿病組相比##P <0.01。IF：免疫熒光。Figure 5. The comparison of the degree of microvascular lesions and sympatheticneuropathy in the bone marrow in each group. (A) Representative examples of highmagnification confocal IF images showing staining of CD31 (red), TH (green), nuclear(DAPI) in bone marrow in each group. Scale bar: 50 mm. (B) Quantitative of positive regionof CD31 red of femur. (C) Quantitative of positive region of TH green of femur.**P <0.01vscontrol group,##P <0.05 vs type 2 diabetes group.5.4 表達CXCR4-骨髓細胞的遷移與SDF-1的濃度水平密切相關前研究表明，在疾病條件下CXCR-4/SDF-1介導細胞的遷移與受損組織高度相關[47.48]，因此，我們檢測在骨髓中是否CXCR4-細胞（CXCR4表達的細胞）與SDF-1相關。通過SDF-1α和CXCR4的IF染色，結果表明在2型糖尿病小鼠骨髓中，CXCR4-細胞的分布與SDF-1α高度相關，并且部分免疫反應顯示CXCR4與SDF-1α存在共定位（見圖6）。我們進一步確認SDF-1的免疫活性處在細胞

圖6 2型糖尿病可以誘導骨髓SDF-1增強CXCR4陽性細胞的動員。激光共聚焦IF圖片顯示各組小鼠股骨的CXCR4（紅）、SDF-1α（綠）、核（DAPI）染色，比列尺：50mm。Figure 6. Type 2 diabetes can induced SDF-1 elevation recruits CXCR4-positive cells inbone marrow. Representative examples of high magnification confocal IF images showingstaining of CXCR4 (red), SDF-1(green), nuclear (DAPI) in bone marrow in Control , in T2DA/Lyz-Cre+T2D. Scale bar: 50 mm.6 小鼠骨髓neuritin表達通過免疫熒光檢測各組小鼠骨髓neuritin的表達量。相比于正常對照db/m小鼠，2型糖尿病組小鼠的neuritin表達量顯著降低, 高表達neuritin+db/m小鼠組的neuritin表達量顯著（P<0.05）；高表達neuritin+2型糖

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊麗;王旭暉;劉春燕;張金莉;黃瑾;;Neuritin在乳腺腺病和乳腺浸潤性導管癌中的表達及臨床意義[J];中國婦幼保健;2016年12期

2 鐘晨;張麗翠;;Neuritin在胃癌組織中的表達[J];世界最新醫(yī)學信息文摘;2015年68期

3 李東正;李靜;王倩;黎興毅;張嶠;于娜;羅星;黃瑾;;Neuritin誘導大鼠骨髓基質細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的電生理研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2010年11期

4 鐘晨;羅星;于娜;黃瑾;;Neuritin真核表達載體的構建及鑒定[J];石河子大學學報(自然科學版);2011年05期

5 張瑩端;李劍波;奚春紅;顏莓;徐寬楓;許馨予;陳恒;王玉成;楊濤;;氧化應激對糖尿病大鼠Neuritin水平和坐骨神經(jīng)功能及超微結構的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2015年11期

6 晏玲飛;李劍波;解敏;顏莓;張紅曼;徐寬楓;許馨予;陳恒;楊濤;陳家偉;;胰島素樣生長因子1對大鼠雪旺細胞Neuritin表達的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2013年11期

7 石敏;李劍波;張紅曼;徐寬楓;許馨予;程恒;沈捷;楊濤;陳家偉;;大鼠雪旺細胞Neuritin的表達[J];江蘇醫(yī)藥;2011年05期

8 顏莓;李劍波;張瑩端;解敏;晏玲飛;陳恒;許馨予;徐寬楓;;轉染高表達Neuritin基因的雪旺細胞在高糖時對背根神經(jīng)節(jié)突起的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2014年03期

9 蔡云鵬;趙冬;許暉;劉祺;戴晶;朱立倉;何學君;楊傳豪;王業(yè)忠;;Neuritin蛋白在腦損傷組織中的時相性表達及意義[J];實用醫(yī)學雜志;2014年15期

10 偉偉;楊佳;;Neuritin基因對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞調節(jié)以及大鼠受損視神經(jīng)的修復作用[J];臨床和實驗醫(yī)學雜志;2017年02期

相關會議論文 前6條

1 陳禮剛;陳有林;彭里磊;劉亮;;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與neuritin基因[A];2011中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學學術會議論文匯編[C];2011年

2 曹文珞;馬浩騫;劉芳;許家軍;;Neuritin在大鼠視神經(jīng)損傷后的表達變化及對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞系的保護作用[A];中國解剖學會2013年年會論文文摘匯編[C];2013年

3 張紅曼;李劍波;晏玲飛;解敏;徐寬楓;許馨予;陳恒;楊濤;陳家偉;;大鼠雪旺細胞neuritin基因ShRNA表達載體構建及其體外抑制效應[A];中華醫(yī)學會第十一次全國內分泌學學術會議論文匯編[C];2012年

4 張紅曼;李劍波;晏玲飛;解敏;徐寬楓;許馨予;陳恒;楊濤;陳家偉;;大鼠雪旺細胞neuritin基因shRNA表達載體構建及其體外抑制效應[A];中華醫(yī)學會糖尿病學分會第十六次全國學術會議論文集[C];2012年

5 李新麗;張樹軍;仙玲玲;于娜;楊磊;黃瑾;;Neuritin在畢赤酵母中的表達及其生物學功能的研究[A];遺傳學進步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

6 單莉婭;;重組人Neuritin蛋白加速小鼠受損坐骨神經(jīng)的結構和功能恢復[A];中國生理學會張錫鈞基金第十四屆全國青年優(yōu)秀生理學學術論文綜合摘要、中國生理學會第十二屆全國青年生理學工作者學術會議論文摘要[C];2017年

相關博士學位論文 前1條

1 姚金晶;Neuritin調節(jié)神經(jīng)元鉀通道Kv4.2α亞單位表達及神經(jīng)元興奮性的機理研究[D];復旦大學;2014年

相關碩士學位論文 前10條

1 劉遠志;骨髓神經(jīng)neuritin對2型糖尿病周圍神經(jīng)病變治療的影響研究[D];西南醫(yī)科大學;2018年

2 李維嘉;Neuritin在胃癌中表達水平的研究[D];石河子大學;2014年

3 顏莓;轉染高表達Neuritin基因的雪旺細胞在高糖下對背根神經(jīng)節(jié)突起的影響[D];南京醫(yī)科大學;2014年

4 陳有林;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與Neuritin基因在膠質瘤中的表達與意義[D];瀘州醫(yī)學院;2011年

5 童瑩;Neuritin蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義[D];新疆醫(yī)科大學;2016年

6 巴鵬飛;人部分組織中neuritin表達檢測及其過表達對細胞凋亡的影響[D];石河子大學;2007年

7 黃延紅;人Neuritin蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達和初步功能鑒定[D];石河子大學;2006年

8 張樹軍;人Neuritin畢赤酵母表達系統(tǒng)的構建及表達產物的功能研究[D];石河子大學;2007年

9 張紅曼;雪旺細胞Neuritin慢病毒shRNA載體構建及其體外功能初探[D];南京醫(yī)科大學;2012年

10 彭方亮;Neuritin在大鼠腦外傷合并骨折中的表達及作用研究[D];石河子大學;2011年

本文編號：2828647