目的:探討miR-17-5p在正常和強直性脊柱炎(AS)患者關節(jié)囊組織中的表達水平差異,進而研究miR-17-5p調(diào)控ANKH的表達影響成纖維細胞異位骨化的細胞生物學機制,為強直性脊柱炎疾病探尋新的治療靶點并提供新的理論依據(jù)。方法:本實驗開始前,進行倫理審查申請并獲得廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。根據(jù)《赫爾辛基宣言》經(jīng)患者及家屬知情同意后,收集由廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科手術切除獲得強直性脊柱炎患者髖關節(jié)囊組織共20份為實驗組,以18份同部位組織為對照組。實驗組所有病例診斷符合1984年美國紐約標準,患者無其他異常情況如風濕等;對照組患者既往身體健康,無強直性脊柱炎及類風濕等的異常情況。將組織切片進行BCIP/NBT、茜素紅染色,比較兩組韌帶組織異位骨化差異;利用實時熒光定量PCR檢測患者韌帶組織中miR-17-5p和ANKH及成骨相關基因mRNA的表達水平,并與對照組的進行比較,確定miR-17-5p和ANKH與強直性脊柱炎的相關性,是否存在負相關關系;利用Western-Blot檢測兩組韌帶組織中ANKH、Runx2、Col1a1蛋白表達水平差異。采用組織塊法分離培養(yǎng)成纖維細胞,進行HE、BCIP/NBT、茜素紅染色,比較兩組細胞形態(tài)及礦化成骨差異;利用實時熒光定量PCR檢測兩組細胞中miR-17-5p和ANKH及成骨相關基因mRNA的表達水平差異;利用Western-Blot檢測兩組細胞中ANKH、Runx2、Col1a1蛋白表達水平差異。利用TargetScan、Miranda等在線預測軟件,分析miR-17-5p與ANKH基因3’UTR上的作用位點。利用分子生物學的方法,克隆得到ANKH基因3’UTR序列,進行生物信息學分析,確定miR-17-5p的結合位點。將ANKH基因3’UTR序列插入到熒光素酶報告基因下游,同時對miR-17-5p結合位點進行序列突變,利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?驗證miR-17-5p通過作用于ANKH基因3’UTR上的結合位點,調(diào)控ANKH基因的表達。采用慢病毒介導的調(diào)控技術,構建miR-17-5p mimic、miR-17-5p inhibitor和miR-17-5p control慢病毒表達載體,包裝慢病毒,感染原代成纖維細胞,可以長期的在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達miR-17-5p mimic、miR-17-5p inhibitor和miR-17-5pcontrol。檢測過表達或抑制miR-17-5p后,ANKH、RUNX2、COL1a1的mRNA及蛋白表達水平的變化,以及鈣化結節(jié)染色檢測成骨分化差異等,在細胞水平進一步證實miR-17-5p直接靶向ANKH并參與鈣化的發(fā)生。結果采用常用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行分析,P㩳0.05說明差異有統(tǒng)計學意義。結果:AS髖關節(jié)囊韌帶組織與正常韌帶中均含有大量成纖維細胞。BCIP/NBT染色可見AS組明顯深染,呈深藍色,而對照組基本未著色;Alizarin Red染色可見AS組有明顯鈣化結節(jié),而對照組未見鈣化結節(jié);實時熒光定量PCR檢測可見miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP在AS標本中mRNA高表達,較對照組明顯升高,而ANKH在AS標本中的mRNA低表達,約為對照組的1/3;Western blot檢測也表明在AS髖關節(jié)韌帶中Col1a1、Runx2蛋白表達均高于對照組,而ANKH蛋白表達明顯低于對照組;堿性磷酸酶活性檢測提示AS組明顯高于對照組。成功從AS髖關節(jié)囊韌帶及對照組韌帶中分離培養(yǎng)成纖維細胞,外觀形態(tài)上二者沒有明顯差別,但Vimentin染色對照組較AS組明顯深染;Alizarin Red染色見AS組成纖維細胞鈣化結節(jié)明顯多于對照組,BCIP/NBT染色見AS組成纖維細胞呈深藍色,而對照組基本未著色;AS來源的成纖維細胞中miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP的mRNA較對照組明顯高表達,ANKH的mRNA低表達,與韌帶組織結果一致;AS來源的成纖維細胞中Col1a1、Runx2蛋白較對照組明顯高表達,ANKH的蛋白低表達,與韌帶組織中蛋白表達結果一致;堿性磷酸酶活性檢測提示AS來源的成纖維細胞明顯高于對照組,與韌帶組織檢測結果一致。TargetScan、Miranda等在線預測軟件均預測ANKH為miR-17-5p的靶基因,野生型ANKH 3’UTR和突變體ANKH 3’UTR的Luciferase報告基因載體構建及鑒定成功,共轉(zhuǎn)染mi R-17-5p模擬物和p MIR/ANKH報告基因載體后,螢光素酶活性明顯降低,而共轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑和p MIR/ANKH報告基因載體后,螢光素酶活性變化不大,共轉(zhuǎn)染miR-17-5p模擬物或抑制劑和p MIR/ANKH/mut報告基因載體后則不影響信號強度。慢病毒構建成功后,能有效轉(zhuǎn)染成纖維細胞。上調(diào)成纖維細胞中miR-17-5p表達水平后,其ANKH的mRNA及蛋白表達水平明顯下降,Col1a1和Runx2的mRNA及蛋白表達上調(diào),而下調(diào)成纖維細胞中miR-17-5p表達水平后,其ANKH的mRNA及蛋白表達水平明顯上調(diào),Col1a1和Runx2的mRNA及蛋白表達水平下降,堿性磷酸酶活性檢測與BCIP/NBT、Alizarin Red染色結果與miR-17-5p水平一致,差異有統(tǒng)計學意義,提示miR-17-5p能抑制ANKH的表達,繼而調(diào)控成纖維細胞的成骨分化。結論:AS髖關節(jié)囊韌帶組織較對照組具有明顯成骨傾向;miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP在AS韌帶組織中mRNA較對照組明顯高表達,在AS來源的成纖維細胞中亦較對照組明顯高表達;Col1a1、Runx2蛋白在AS韌帶組織中明顯較對照組高表達,同時在AS來源的成纖維細胞中亦明顯較對照組高表達;ANKH在AS韌帶組織中mRNA及蛋白均較對照組低表達,在AS來源的成纖維細胞中亦較對照組低表達,與miR-17-5p的表達水平負相關;miR-17-5p可負性調(diào)控ANKH表達,參與成纖維細胞的成骨分化;上調(diào)成纖維細胞的miR-17-5p表達后能夠促進成纖維細胞成骨分化,而下調(diào)成纖維細胞的miR-17-5p表達后能夠抑制成纖維細胞成骨分化,這可能是強直性脊柱炎患者關節(jié)周圍韌帶成纖維細胞異位成骨的一個原因,有可能成為治療強直性脊柱炎的潛在靶點。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R593.23
【部分圖文】：

圖 1-1 關節(jié)囊組織 HE 染色 Control:對照組,AS: 強直性脊柱炎組Figure 1-1 HE staining of joint capsules酶染色及茜素紅染色T 染色（圖 1-2）可見強直性脊柱炎組呈深藍色，而染色(圖 1-3)可見強直性脊柱炎組有鈣化結節(jié)，而成。

圖 1-1 關節(jié)囊組織 HE 染色 Control:對照組,AS: 強直性脊柱炎組Figure 1-1 HE staining of joint capsules酶染色及茜素紅染色T 染色（圖 1-2）可見強直性脊柱炎組呈深藍色，而染色(圖 1-3)可見強直性脊柱炎組有鈣化結節(jié)，而成。

酶染色及茜素紅染色T 染色（圖 1-2）可見強直性脊柱炎組呈深藍色，而紅染色(圖 1-3)可見強直性脊柱炎組有鈣化結節(jié)，而成。圖 1-2 BCIP/NBT 染色 Control:對照組,AS: 強直性脊柱炎組Figure 1-2 BCIP/NBT staining

【參考文獻】

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本文編號：2824282