目的:探討miR-17-5p在正常和強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者關(guān)節(jié)囊組織中的表達(dá)水平差異,進(jìn)而研究miR-17-5p調(diào)控ANKH的表達(dá)影響成纖維細(xì)胞異位骨化的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,為強(qiáng)直性脊柱炎疾病探尋新的治療靶點(diǎn)并提供新的理論依據(jù)。方法:本實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,進(jìn)行倫理審查申請(qǐng)并獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)《赫爾辛基宣言》經(jīng)患者及家屬知情同意后,收集由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科手術(shù)切除獲得強(qiáng)直性脊柱炎患者髖關(guān)節(jié)囊組織共20份為實(shí)驗(yàn)組,以18份同部位組織為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組所有病例診斷符合1984年美國(guó)紐約標(biāo)準(zhǔn),患者無(wú)其他異常情況如風(fēng)濕等;對(duì)照組患者既往身體健康,無(wú)強(qiáng)直性脊柱炎及類風(fēng)濕等的異常情況。將組織切片進(jìn)行BCIP/NBT、茜素紅染色,比較兩組韌帶組織異位骨化差異;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)患者韌帶組織中miR-17-5p和ANKH及成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平,并與對(duì)照組的進(jìn)行比較,確定miR-17-5p和ANKH與強(qiáng)直性脊柱炎的相關(guān)性,是否存在負(fù)相關(guān)關(guān)系;利用Western-Blot檢測(cè)兩組韌帶組織中ANKH、Runx2、Col1a1蛋白表達(dá)水平差異。采用組織塊法分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,進(jìn)行HE、BCIP/NBT、茜素紅染色,比較兩組細(xì)胞形態(tài)及礦化成骨差異;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中miR-17-5p和ANKH及成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平差異;利用Western-Blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中ANKH、Runx2、Col1a1蛋白表達(dá)水平差異。利用TargetScan、Miranda等在線預(yù)測(cè)軟件,分析miR-17-5p與ANKH基因3’UTR上的作用位點(diǎn)。利用分子生物學(xué)的方法,克隆得到ANKH基因3’UTR序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,確定miR-17-5p的結(jié)合位點(diǎn)。將ANKH基因3’UTR序列插入到熒光素酶報(bào)告基因下游,同時(shí)對(duì)miR-17-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行序列突變,利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),驗(yàn)證miR-17-5p通過(guò)作用于ANKH基因3’UTR上的結(jié)合位點(diǎn),調(diào)控ANKH基因的表達(dá)。采用慢病毒介導(dǎo)的調(diào)控技術(shù),構(gòu)建miR-17-5p mimic、miR-17-5p inhibitor和miR-17-5p control慢病毒表達(dá)載體,包裝慢病毒,感染原代成纖維細(xì)胞,可以長(zhǎng)期的在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)miR-17-5p mimic、miR-17-5p inhibitor和miR-17-5pcontrol。檢測(cè)過(guò)表達(dá)或抑制miR-17-5p后,ANKH、RUNX2、COL1a1的mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化,以及鈣化結(jié)節(jié)染色檢測(cè)成骨分化差異等,在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)miR-17-5p直接靶向ANKH并參與鈣化的發(fā)生。結(jié)果采用常用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行分析,P㩳0.05說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:AS髖關(guān)節(jié)囊韌帶組織與正常韌帶中均含有大量成纖維細(xì)胞。BCIP/NBT染色可見(jiàn)AS組明顯深染,呈深藍(lán)色,而對(duì)照組基本未著色;Alizarin Red染色可見(jiàn)AS組有明顯鈣化結(jié)節(jié),而對(duì)照組未見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)可見(jiàn)miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP在AS標(biāo)本中mRNA高表達(dá),較對(duì)照組明顯升高,而ANKH在AS標(biāo)本中的mRNA低表達(dá),約為對(duì)照組的1/3;Western blot檢測(cè)也表明在AS髖關(guān)節(jié)韌帶中Col1a1、Runx2蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組,而ANKH蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組;堿性磷酸酶活性檢測(cè)提示AS組明顯高于對(duì)照組。成功從AS髖關(guān)節(jié)囊韌帶及對(duì)照組韌帶中分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,外觀形態(tài)上二者沒(méi)有明顯差別,但Vimentin染色對(duì)照組較AS組明顯深染;Alizarin Red染色見(jiàn)AS組成纖維細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)明顯多于對(duì)照組,BCIP/NBT染色見(jiàn)AS組成纖維細(xì)胞呈深藍(lán)色,而對(duì)照組基本未著色;AS來(lái)源的成纖維細(xì)胞中miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP的mRNA較對(duì)照組明顯高表達(dá),ANKH的mRNA低表達(dá),與韌帶組織結(jié)果一致;AS來(lái)源的成纖維細(xì)胞中Col1a1、Runx2蛋白較對(duì)照組明顯高表達(dá),ANKH的蛋白低表達(dá),與韌帶組織中蛋白表達(dá)結(jié)果一致;堿性磷酸酶活性檢測(cè)提示AS來(lái)源的成纖維細(xì)胞明顯高于對(duì)照組,與韌帶組織檢測(cè)結(jié)果一致。TargetScan、Miranda等在線預(yù)測(cè)軟件均預(yù)測(cè)ANKH為miR-17-5p的靶基因,野生型ANKH 3’UTR和突變體ANKH 3’UTR的Luciferase報(bào)告基因載體構(gòu)建及鑒定成功,共轉(zhuǎn)染mi R-17-5p模擬物和p MIR/ANKH報(bào)告基因載體后,螢光素酶活性明顯降低,而共轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑和p MIR/ANKH報(bào)告基因載體后,螢光素酶活性變化不大,共轉(zhuǎn)染miR-17-5p模擬物或抑制劑和p MIR/ANKH/mut報(bào)告基因載體后則不影響信號(hào)強(qiáng)度。慢病毒構(gòu)建成功后,能有效轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。上調(diào)成纖維細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)水平后,其ANKH的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降,Col1a1和Runx2的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào),而下調(diào)成纖維細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)水平后,其ANKH的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),Col1a1和Runx2的mRNA及蛋白表達(dá)水平下降,堿性磷酸酶活性檢測(cè)與BCIP/NBT、Alizarin Red染色結(jié)果與miR-17-5p水平一致,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示miR-17-5p能抑制ANKH的表達(dá),繼而調(diào)控成纖維細(xì)胞的成骨分化。結(jié)論:AS髖關(guān)節(jié)囊韌帶組織較對(duì)照組具有明顯成骨傾向;miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP在AS韌帶組織中mRNA較對(duì)照組明顯高表達(dá),在AS來(lái)源的成纖維細(xì)胞中亦較對(duì)照組明顯高表達(dá);Col1a1、Runx2蛋白在AS韌帶組織中明顯較對(duì)照組高表達(dá),同時(shí)在AS來(lái)源的成纖維細(xì)胞中亦明顯較對(duì)照組高表達(dá);ANKH在AS韌帶組織中mRNA及蛋白均較對(duì)照組低表達(dá),在AS來(lái)源的成纖維細(xì)胞中亦較對(duì)照組低表達(dá),與miR-17-5p的表達(dá)水平負(fù)相關(guān);miR-17-5p可負(fù)性調(diào)控ANKH表達(dá),參與成纖維細(xì)胞的成骨分化;上調(diào)成纖維細(xì)胞的miR-17-5p表達(dá)后能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞成骨分化,而下調(diào)成纖維細(xì)胞的miR-17-5p表達(dá)后能夠抑制成纖維細(xì)胞成骨分化,這可能是強(qiáng)直性脊柱炎患者關(guān)節(jié)周圍韌帶成纖維細(xì)胞異位成骨的一個(gè)原因,有可能成為治療強(qiáng)直性脊柱炎的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R593.23
【部分圖文】：

圖 1-1 關(guān)節(jié)囊組織 HE 染色 Control:對(duì)照組,AS: 強(qiáng)直性脊柱炎組Figure 1-1 HE staining of joint capsules酶染色及茜素紅染色T 染色（圖 1-2）可見(jiàn)強(qiáng)直性脊柱炎組呈深藍(lán)色，而染色(圖 1-3)可見(jiàn)強(qiáng)直性脊柱炎組有鈣化結(jié)節(jié)，而成。

圖 1-1 關(guān)節(jié)囊組織 HE 染色 Control:對(duì)照組,AS: 強(qiáng)直性脊柱炎組Figure 1-1 HE staining of joint capsules酶染色及茜素紅染色T 染色（圖 1-2）可見(jiàn)強(qiáng)直性脊柱炎組呈深藍(lán)色，而染色(圖 1-3)可見(jiàn)強(qiáng)直性脊柱炎組有鈣化結(jié)節(jié)，而成。

酶染色及茜素紅染色T 染色（圖 1-2）可見(jiàn)強(qiáng)直性脊柱炎組呈深藍(lán)色，而紅染色(圖 1-3)可見(jiàn)強(qiáng)直性脊柱炎組有鈣化結(jié)節(jié)，而成。圖 1-2 BCIP/NBT 染色 Control:對(duì)照組,AS: 強(qiáng)直性脊柱炎組Figure 1-2 BCIP/NBT staining

【參考文獻(xiàn)】

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