前言:橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis,HT),又稱橋本病,是一種器官特異性的自身免疫疾病,患者甲狀腺組織內(nèi)可見大量的淋巴細胞浸潤,是臨床中導致甲狀腺功能減退最重要的病因之一。目前關于HT的相關研究逐漸增多,其中炎癥因子對HT的影響起著十分重要的作用。IL-34作為CSF-1R的配體被發(fā)現(xiàn),目前的研究表明IL-34在神經(jīng)元保護、骨退行性疾病、延遲超敏反應、感染、腫瘤和器官移植中均發(fā)揮著作用。此外,IL-34對炎性疾的發(fā)生、發(fā)展有著重要的影響,如炎癥性腸病(IBD)和類風濕性關節(jié)炎(RA)等。本課題前期研究提示橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織中IL-34 mRNA的水平顯著低于非橋本甲狀腺炎患者,提示IL-34可能參與了HT的病理生理過程。本研究旨在明確IL-34在HT中的變化,探討IL-34在HT中可能的作用機制。研究方法:本研究收集行甲狀腺切除術患者的癌旁或結(jié)節(jié)旁甲狀腺組織,根據(jù)患者甲狀腺病理結(jié)果分為橋本甲狀腺炎組(HT組,n=24)和非橋本甲狀腺炎組(非HT組,n=23)。收取橋本甲狀腺炎病患者(HT組,n=35)及健康對照人群(Control組,n=21)的外周血。免疫組化的方法觀察IL-34在甲狀腺組織的表達;實時定量PCR(RT-PCR)檢測甲狀腺組織IL-34 mRNA水平的表達,Western Blot檢測甲狀腺組織IL-34蛋白的表達水平;使用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清中IL-34的水平;干擾素-γ(IFN-γ)刺激Nthy-ori 3-1細胞,RT-PCR和Western Blot檢測,觀察在Nthy-ori 3-1細胞IL-34表達的變化。培養(yǎng)HT患者的原代甲狀腺細胞,流式細胞分析甲狀腺細胞的凋亡比例,觀察HT患者原代甲狀腺細胞IL-34刺激后甲狀腺細胞凋亡比例變化情況;通過RT-PCR和Western Blot檢測IL34刺激后的原代甲狀腺細胞中Bcl-2/Bax表達的變化;RT-PCR檢測和Western Bolt,在IL-34刺激的同時抑制CSF-1R,觀察原代甲狀腺細胞中STAT3磷酸化水平的變化情況,此外,在原代甲狀腺細胞中抑制STAT3,觀察IL-34對甲狀腺細胞凋亡相關指標Bcl-2/Bax表達的影響。本研究應用NOD.H-2~(h4)小鼠建立自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎(spontaneous autoimmune thyroiditis,SAT)模型,選擇4周齡NOD.H-2~(h4)小鼠,隨機分為對照組(Contro1組,n=16)和自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎組(SAT組,n=16)。Control組喂以普通無菌水;SAT組小鼠給予含0.05%碘化鈉的無菌水8周誘導發(fā)生自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎;根據(jù)喂養(yǎng)時間分為:喂養(yǎng)8周組和喂養(yǎng)16周組,共計4組,小鼠于4周齡時啟動高碘喂養(yǎng)。取甲狀腺組織行HE染色,RT-PCR和Western Blot檢測IL-34的表達情況。結(jié)果:1.免疫組化染色顯示IL-34表達在甲狀腺濾泡上皮細胞,在HT組患者的甲狀腺組織中不僅甲狀腺濾泡上皮細胞可見IL-34的表達,浸潤的炎癥細胞也可見IL-34的表達2.HT患者的甲狀腺組織中IL-34的mRNA和蛋白表達水平均顯著低于對照組(P0.05),且IL-34的mRNA表達水平與TPOAb和TgAb水平均呈顯著負相關(P0.05)。3.血清中HT組IL-34的水平明顯低于對照組(P0.05),且血清IL-34的水平與TgAb水平呈顯著的負相關(P0.05)。4.HE染色提示SAT組NOD.H-2~(h4)小鼠發(fā)生自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎,SAT組甲狀腺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)淋巴細胞浸潤明顯。5.RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示與同周齡對照組小鼠比較,SAT組小鼠甲狀腺組織IL-34的表達水平明顯降低(P0.05);6.RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示IFN-γ刺激Nthy-ori 3-1細胞,導致Nthy-ori 3-1細胞IL-34表達明顯降低(P0.05);7.IL-34刺激后的原代甲狀腺細胞凋亡比例較對照組顯著降低(P0.05),RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示IL-34單獨刺激組凋亡相關指標Bcl-2/Bax顯著高于對照組(P0.01,P0.01);8.在IL-34刺激的原代甲狀腺細胞中,特異性的抑制CSF-1R后,IL-34+CSF-1R抑制組甲狀腺細胞的凋亡比例較IL-34單獨刺激組明顯升高(P0.05),RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示IL-34單獨刺激組凋亡相關指標Bcl-2/Bax顯著高于IL-34+CSF-1R抑制組(P0.01,P0.05),同時IL-34單獨刺激組STAT3磷酸化的水平較對照組顯著升高(P0.01),IL-34+CSF-1R抑制組STAT3磷酸化的水平較IL-34單獨刺激組顯著降低(P0.01);9.特異性的抑制STAT3后,RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示IL-34+STAT3抑制組凋亡相關指標Bcl-2/Bax較對照組顯著降低(P0.05,P0.05),IL-34+STAT3抑制組凋亡相關指標Bcl-2/Bax較IL-34單獨刺激組顯著降低(P0.01,P0.05)。結(jié)論:1.本研究發(fā)現(xiàn)HT患者和SAT小鼠甲狀腺組織IL-34表達及患者血清IL-34水平均顯著低于對照組,且IL-34表達量與甲狀腺自身抗體水平負相關;IFN-γ刺激致甲狀腺細胞IL-34分泌的減少,綜上所述提示IL-34降低可能與甲狀腺細胞炎癥損傷有關。2.經(jīng)IL-34刺激后HT患者的甲狀腺細胞凋亡比例顯著降低,提示IL-34可以抑制HT患者甲狀腺細胞的凋亡,并且可能是CSF-1R/STAT3/p-STAT3信號參與介導來實現(xiàn)的。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R581.4
【部分圖文】：

95℃ （升溫速率 0.11℃/秒，采集模式：持續(xù)）1cycle降溫 50℃ 30sec（升溫速率 2.2℃/秒）1cycle2.3.3 ELISA 方法檢測血清IL-34水平ELISA檢測血清中IL-34 的水平1）取出-80℃凍存的血清標本，置于冰上融化；2）取人IL-34試劑盒，于室溫放置30min；3）用ddH2O將20×的Wash Buffer稀釋為1×的Wash Buffer，待用；4）按照說明書上將IL-34標準品按照標簽提示配制成終濃度為100 ng/ml，緩慢搖晃15min使其完全溶解；5）待標準品完全溶解后，根據(jù)圖2.1的方法配制不同濃度梯度的標準品；

中國醫(yī)科大學博士學位論文TSH(mU/ml) 1.20(0.97-1.68) 1.33(1.01-2.14) 0.062FT3(pmol/L) 4.88±0.45 4.45±0.73 0.056FT4(pmol/L) 13.43±1.63 12.84±1.94 0.649TPOAb(IU/mL) 0.40(0.21-0.65) 102.63(5.53-304.96) <0.001TgAb(IU/mL) 1.33(1.10-2.27) 29.01(9.76-225.91) <0.001參考值范圍: FT4: 9.01-19.05 pmol/L; FT3: 2.63-5.70 pmol/L; TSH: 0.35-4.94 mU/mL; TPOAb:0.00-5.61 IU/mL; TgAb: 0.00-4.11 IU/mL3.1.2 甲狀腺組織中存在 IL-34 的表達非 HT 組患者（n=6）的甲狀腺濾泡上皮細胞可見 IL-34 的表達，在 HT 組患者（n=6）的甲狀腺組織中濾泡上皮細胞和炎癥細胞均有 IL-34 的表達（如圖 3.1）。

HT 組(n=10)甲狀腺組織中 IL-34 的蛋白表達水平顯著低于非 HT 組(n=10)（P< 0.05）（如圖 3.2）。圖3.2 人甲狀腺組織IL-34蛋白的表達水平HT 組(n=23)甲狀腺組織中IL-34的mRNA水平顯著低于非HT組(n=24)（P <0.05）；Spearman相關分析提示IL-34 mRNA的表達水平與甲狀腺自身免疫抗體TgAb（r=-0.356, P = 0.019）和 TPOAb（r=-0.365, P = 0.015）均呈顯著負相關（如圖 3.3）

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本文編號：2823740