目的:近年來國外的研究發(fā)現(xiàn)以18-羥皮質(zhì)醇(18-OHF)為代表的類固醇激素在醛固酮瘤(APA)患者外周血中明顯升高,由于此型患者可通過手術(shù)治愈或緩解,有學(xué)者認(rèn)為類固醇激素有望成為早期識別APA的生物標(biāo)志物,用于篩選真正需要行腎上腺靜脈取血(AVS)分型定側(cè)的原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)患者。進一步的研究發(fā)現(xiàn)血漿類固醇的升高與KCNJ5基因突變特異性相關(guān)聯(lián),可能與腎上腺病變組織球狀帶和束狀帶樣細胞及其酶系表達的程度及差異有關(guān)。目前國人的血漿類固醇水平與不同亞型PA及體細胞突變的關(guān)系尚不清楚。本研究擬采用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定待分型的可疑單側(cè)型PA患者的血漿18-OHF濃度,與金標(biāo)準(zhǔn)AVS分型結(jié)果進行比較,初步評價血漿18-OHF對原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)分型診斷的價值;同時測定手術(shù)患者腎上腺病變組織的體細胞突變,進一步分析血漿18-OHF與體細胞突變的關(guān)系。為此,1.首先,建立LC-MS/MS定量分析測定血漿18-OHF濃度的方法。2.研究血漿18-OHF水平與不同亞型PA的關(guān)系及其對單側(cè)型PA的診斷價值。3.明確目前已報導(dǎo)的5種體細胞突變(KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1)的常見突變位點在手術(shù)PA患者中的發(fā)生率及其相應(yīng)的臨床表型。4.研究血漿18-OHF水平與體細胞突變的關(guān)系。方法:1.通過查閱文獻,確定LC-MS/MS測定血漿18-OHF濃度的實驗方法、條件及技術(shù)路線。收集2016年12月在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓診療中心確診為PA并經(jīng)過AVS分型診斷的PA患者血樣10份(包括外周血樣及腎上腺靜脈血樣),采用5500 QTRAP質(zhì)譜儀(AB SCIEX)進行預(yù)實驗,建立LC-MS/MS測定血漿18-OHF的方法,并進行方法學(xué)驗證評價其靈敏度、精密度及專屬性。2.繼續(xù)納入2017年1月至12月在我中心定性診斷為PA、結(jié)合腎上腺CT結(jié)果疑似為單側(cè)的待分型PA患者,以AVS為金標(biāo)準(zhǔn)進行分型診斷,同時收集研究對象的外周血樣,采用預(yù)實驗成功建立的LC-MS/MS方法測定其外周血18-OHF濃度,分析血漿18-OHF水平與不同亞型PA的關(guān)系及其對單側(cè)型PA的診斷價值。3.(1)收集35例手術(shù)PA患者的腎上腺瘤體或增生組織,保存于液氮罐中,提取組織DNA,通過設(shè)計的6對引物,對目標(biāo)基因KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-區(qū)段1、CTNNB1 exon3六個片段進行PCR直接測序,分析這些片段中的突變位點及其相應(yīng)的臨床表型。(2)分析35例手術(shù)患者血漿18-OHF濃度與體細胞基因突變的關(guān)系。結(jié)果:1.預(yù)實驗建立的LC-MS/MS測定血漿18-OHF濃度的方法具有較好的靈敏度、精密度及專屬性,能夠?qū)ρ獫{18-OHF進行定量分析,樣本制備重復(fù)性好,數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠,為進一步開展后續(xù)研究奠定了堅實基礎(chǔ)。2.共納入45例可疑為單側(cè)型的待分型PA患者,經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)AVS分型診斷:24例為單側(cè)型PA、21例為雙側(cè)型PA。(1)與雙側(cè)型PA患者相比,單側(cè)型PA患者的血鉀水平較低(3.21±0.45 vs 3.47±0.34 mmol/L,P=0.038);血漿醛固酮濃度(PAC)較高(26.6±8.0vs 21.5±8.8 ng/dL,P=0.051),差異接近統(tǒng)計學(xué)意義;兩組間年齡、性別比例、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、體重指數(shù)(BMI)、醛固酮/腎素活性比值(ARR)、血漿腎素活性(PRA)、空腹血糖、血鈉及血肌酐水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(2)Spearman相關(guān)分析顯示:PA患者的血漿18-OHF濃度與ARR呈正相關(guān)(r=0.37,P=0.013),與PRA(r=-0.32,P=0.034)及血鉀(r=-0.31,P=0.04)呈負(fù)相關(guān)。(3)血漿18-OHF濃度在單側(cè)型PA患者中明顯高于雙側(cè)型PA患者[2.16(0.73,3.66)vs 0.78(0.14,1.15)ng/mL,P=0.001]。(4)采用二元Logistic回歸分析患者年齡、性別、血鉀水平、PAC及血漿18-OHF濃度與單側(cè)型PA的關(guān)系,結(jié)果顯示:血漿18-OHF(OR=4.24,P=0.007)、血鉀(OR=0.04,P=0.034)對單側(cè)型PA有統(tǒng)計學(xué)意義;而PAC、ARR、年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)意義;提示血漿18-OHF濃度每增加1ng/mL其為單側(cè)型PA的優(yōu)勢比為4.24。(5)ROC曲線分析顯示血漿18-OHF診斷單側(cè)型PA的曲線下面積(AUC)為0.806,最佳切點為1.74 ng/mL,敏感性為65.2%,特異性為90.5%,約登指數(shù)(YI)為0.557,陽性似然比為6.8,其診斷效能優(yōu)于經(jīng)典指標(biāo)PAC(AUC=0.710,敏感性為73.9%,特異性為66.7%,陽性似然比為4.1)及ARR(AUC=0.588,敏感性為69.6%,特異性為57.1%,陽性似然比為1.6)。(6)以上述血漿18-OHF最佳切點作為分型標(biāo)準(zhǔn)與金標(biāo)準(zhǔn)AVS分型結(jié)果進行比較,其陽性預(yù)測值為88.2%,陰性預(yù)測值為70.3%,兩種分型方法的Kappa值為0.55,P0.001,提示兩種方法診斷結(jié)果的一致性為中等。3.對35例手術(shù)PA患者腎上腺組織的KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-區(qū)段1、CTNNB1 exon3六個片段進行PCR直接測序分析。(1)基因測序結(jié)果:(1)11例PA患者存在KCNJ5基因錯義突變(4例G151R,7例L168R),總突變率為31.4%;(2)8例患者存在CACNA1D基因rs117630105 C/T突變,突變率為22.9%;(3)未發(fā)現(xiàn)ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1-區(qū)段1,CTNNB1 exon3片段存在突變位點。(2)基因突變與臨床表型的關(guān)系:(1)KCNJ5基因突變型患者中單側(cè)型PA的比例明顯高于野生型患者(81.8%vs 45.8%,P=0.049)。KCNJ5突變型患者與野生型相比,其性別比例、年齡、SBP、DBP、PRA、PAC、血鉀、24小時尿鉀、ARR及腫瘤直徑等指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);(2)CACNA1D基因突變患者中3例為雙側(cè)型PA,5例為單側(cè)型PA,7例為女性,1例為男性,年齡明顯小于野生型(44.3±6.2 vs 51.9±8.6歲,P0.05),兩組間SBP、DBP、PRA、PAC、血鉀、24小時尿鉀、ARR及腫瘤直徑無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)血漿18-OHF濃度與基因突變的關(guān)系:(1)KCNJ5基因突變患者的血漿18-OHF濃度明顯高于野生型[1.95(1.19,2.70)vs 0.73(0.42,1.41)ng/mL,P=0.034];(2)CACNA1D基因突變患者的血漿18-OHF濃度與野生型相比無統(tǒng)計學(xué)差異[0.59(0.32,2.70)vs1.15(0.60,2.16)ng/mL,P=0.516];(3)以血漿18-OHF1.74ng/mL為切點,將患者分為高18-OHF組與低18-OHF組,KCNJ5突變在高18-OHF患者中的比例明顯高于低18-OHF患者(58.3%vs 18.2%,P=0.017)。而CACNA1D突變比例在兩組間無明顯差異(25.0%vs 22.7%,P=1.0)。結(jié)論:1.本研究成功建立了LC-MS/MS測定血漿18-OHF濃度的方法,具有較好的靈敏度及專屬性,能夠?qū)ρ獫{18-OHF進行絕對定量,樣本制備重復(fù)性好,數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠,為進一步開展后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。2.血漿18-OHF濃度在單側(cè)型PA患者中明顯高于雙側(cè)型PA患者;與金標(biāo)準(zhǔn)AVS相比,血漿18-OHF對單側(cè)型PA具有一定的診斷價值,但由于樣本量小,還需擴大樣本量進一步在PA患者中驗證。3.35例PA患者中發(fā)現(xiàn)KCNJ5基因G151R、L168R突變率為31.4%,CACNA1D基因rs117630105 C/T突變率為22.9%;未發(fā)現(xiàn)ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1突變。4.血漿18-OHF濃度的升高與KCNJ5基因突變有關(guān),未發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)與CACNA1D基因突變存在相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R586.24
【部分圖文】：

前 言系，還與患者的預(yù)后關(guān)系非常密切，早期識別 KCNJ5 突變型 APA 患者意義重大由于 IHA 的治療方式首選藥物治療，腎上腺組織標(biāo)本不易獲取，以往針對 IHA 腎上腺增生組織體細胞突變的研究較少，其發(fā)病機制至今尚未闡明。不過，近年的研究在 IHA 方面也取得了一定的進展。Yamazaki Y 等人[72]發(fā)現(xiàn)在 CT 陰性（提示腎上腺增生或微腺瘤）的 PA 患者腎上腺組織中發(fā)現(xiàn) L-型電壓依賴性鈣離子通道α1亞基（CACNA1D）基因突變率高達 65%。近期發(fā)表在 Hypertension 雜志的一項研究發(fā)現(xiàn)在 15 例 IHA 患者腎上腺增生組織中發(fā)現(xiàn)在用 CYP11B2 標(biāo)記的醛固酮分泌細胞簇（aldosterone-producing cell clusters, APCC）區(qū)域中檢測到的 CACNA1D 變異率高達 58%，提示不同的體細胞突變參與了不同亞型 PA 的發(fā)生發(fā)展[73]。

圖 1-1 空白溶液 XIC 圖譜Fig. 1-1 blank solution XIC spectrum圖 1-2 25ng/mL18-OHF 標(biāo)準(zhǔn)品加入 IS 的 XIC 圖譜Fig. 1-2 XIC spectrum of 25ng/mL 18-OHF standard reagent added to IS

建立的色譜-質(zhì)譜方法能檢測到 18-OHF，并且 18-OHF 和 IS 色譜分離，峰形及專屬性較好。圖 1-1 空白溶液 XIC 圖譜Fig. 1-1 blank solution XIC spectrum

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