目的:近年來(lái)國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)以18-羥皮質(zhì)醇(18-OHF)為代表的類固醇激素在醛固酮瘤(APA)患者外周血中明顯升高,由于此型患者可通過(guò)手術(shù)治愈或緩解,有學(xué)者認(rèn)為類固醇激素有望成為早期識(shí)別APA的生物標(biāo)志物,用于篩選真正需要行腎上腺靜脈取血(AVS)分型定側(cè)的原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)患者。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)血漿類固醇的升高與KCNJ5基因突變特異性相關(guān)聯(lián),可能與腎上腺病變組織球狀帶和束狀帶樣細(xì)胞及其酶系表達(dá)的程度及差異有關(guān)。目前國(guó)人的血漿類固醇水平與不同亞型PA及體細(xì)胞突變的關(guān)系尚不清楚。本研究擬采用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定待分型的可疑單側(cè)型PA患者的血漿18-OHF濃度,與金標(biāo)準(zhǔn)AVS分型結(jié)果進(jìn)行比較,初步評(píng)價(jià)血漿18-OHF對(duì)原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)分型診斷的價(jià)值;同時(shí)測(cè)定手術(shù)患者腎上腺病變組織的體細(xì)胞突變,進(jìn)一步分析血漿18-OHF與體細(xì)胞突變的關(guān)系。為此,1.首先,建立LC-MS/MS定量分析測(cè)定血漿18-OHF濃度的方法。2.研究血漿18-OHF水平與不同亞型PA的關(guān)系及其對(duì)單側(cè)型PA的診斷價(jià)值。3.明確目前已報(bào)導(dǎo)的5種體細(xì)胞突變(KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1)的常見(jiàn)突變位點(diǎn)在手術(shù)PA患者中的發(fā)生率及其相應(yīng)的臨床表型。4.研究血漿18-OHF水平與體細(xì)胞突變的關(guān)系。方法:1.通過(guò)查閱文獻(xiàn),確定LC-MS/MS測(cè)定血漿18-OHF濃度的實(shí)驗(yàn)方法、條件及技術(shù)路線。收集2016年12月在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓診療中心確診為PA并經(jīng)過(guò)AVS分型診斷的PA患者血樣10份(包括外周血樣及腎上腺靜脈血樣),采用5500 QTRAP質(zhì)譜儀(AB SCIEX)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),建立LC-MS/MS測(cè)定血漿18-OHF的方法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證評(píng)價(jià)其靈敏度、精密度及專屬性。2.繼續(xù)納入2017年1月至12月在我中心定性診斷為PA、結(jié)合腎上腺CT結(jié)果疑似為單側(cè)的待分型PA患者,以AVS為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型診斷,同時(shí)收集研究對(duì)象的外周血樣,采用預(yù)實(shí)驗(yàn)成功建立的LC-MS/MS方法測(cè)定其外周血18-OHF濃度,分析血漿18-OHF水平與不同亞型PA的關(guān)系及其對(duì)單側(cè)型PA的診斷價(jià)值。3.(1)收集35例手術(shù)PA患者的腎上腺瘤體或增生組織,保存于液氮罐中,提取組織DNA,通過(guò)設(shè)計(jì)的6對(duì)引物,對(duì)目標(biāo)基因KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-區(qū)段1、CTNNB1 exon3六個(gè)片段進(jìn)行PCR直接測(cè)序,分析這些片段中的突變位點(diǎn)及其相應(yīng)的臨床表型。(2)分析35例手術(shù)患者血漿18-OHF濃度與體細(xì)胞基因突變的關(guān)系。結(jié)果:1.預(yù)實(shí)驗(yàn)建立的LC-MS/MS測(cè)定血漿18-OHF濃度的方法具有較好的靈敏度、精密度及專屬性,能夠?qū)ρ獫{18-OHF進(jìn)行定量分析,樣本制備重復(fù)性好,數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠,為進(jìn)一步開(kāi)展后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。2.共納入45例可疑為單側(cè)型的待分型PA患者,經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)AVS分型診斷:24例為單側(cè)型PA、21例為雙側(cè)型PA。(1)與雙側(cè)型PA患者相比,單側(cè)型PA患者的血鉀水平較低(3.21±0.45 vs 3.47±0.34 mmol/L,P=0.038);血漿醛固酮濃度(PAC)較高(26.6±8.0vs 21.5±8.8 ng/dL,P=0.051),差異接近統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組間年齡、性別比例、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、體重指數(shù)(BMI)、醛固酮/腎素活性比值(ARR)、血漿腎素活性(PRA)、空腹血糖、血鈉及血肌酐水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)Spearman相關(guān)分析顯示:PA患者的血漿18-OHF濃度與ARR呈正相關(guān)(r=0.37,P=0.013),與PRA(r=-0.32,P=0.034)及血鉀(r=-0.31,P=0.04)呈負(fù)相關(guān)。(3)血漿18-OHF濃度在單側(cè)型PA患者中明顯高于雙側(cè)型PA患者[2.16(0.73,3.66)vs 0.78(0.14,1.15)ng/mL,P=0.001]。(4)采用二元Logistic回歸分析患者年齡、性別、血鉀水平、PAC及血漿18-OHF濃度與單側(cè)型PA的關(guān)系,結(jié)果顯示:血漿18-OHF(OR=4.24,P=0.007)、血鉀(OR=0.04,P=0.034)對(duì)單側(cè)型PA有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而PAC、ARR、年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;提示血漿18-OHF濃度每增加1ng/mL其為單側(cè)型PA的優(yōu)勢(shì)比為4.24。(5)ROC曲線分析顯示血漿18-OHF診斷單側(cè)型PA的曲線下面積(AUC)為0.806,最佳切點(diǎn)為1.74 ng/mL,敏感性為65.2%,特異性為90.5%,約登指數(shù)(YI)為0.557,陽(yáng)性似然比為6.8,其診斷效能優(yōu)于經(jīng)典指標(biāo)PAC(AUC=0.710,敏感性為73.9%,特異性為66.7%,陽(yáng)性似然比為4.1)及ARR(AUC=0.588,敏感性為69.6%,特異性為57.1%,陽(yáng)性似然比為1.6)。(6)以上述血漿18-OHF最佳切點(diǎn)作為分型標(biāo)準(zhǔn)與金標(biāo)準(zhǔn)AVS分型結(jié)果進(jìn)行比較,其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.2%,陰性預(yù)測(cè)值為70.3%,兩種分型方法的Kappa值為0.55,P0.001,提示兩種方法診斷結(jié)果的一致性為中等。3.對(duì)35例手術(shù)PA患者腎上腺組織的KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-區(qū)段1、CTNNB1 exon3六個(gè)片段進(jìn)行PCR直接測(cè)序分析。(1)基因測(cè)序結(jié)果:(1)11例PA患者存在KCNJ5基因錯(cuò)義突變(4例G151R,7例L168R),總突變率為31.4%;(2)8例患者存在CACNA1D基因rs117630105 C/T突變,突變率為22.9%;(3)未發(fā)現(xiàn)ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1-區(qū)段1,CTNNB1 exon3片段存在突變位點(diǎn)。(2)基因突變與臨床表型的關(guān)系:(1)KCNJ5基因突變型患者中單側(cè)型PA的比例明顯高于野生型患者(81.8%vs 45.8%,P=0.049)。KCNJ5突變型患者與野生型相比,其性別比例、年齡、SBP、DBP、PRA、PAC、血鉀、24小時(shí)尿鉀、ARR及腫瘤直徑等指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);(2)CACNA1D基因突變患者中3例為雙側(cè)型PA,5例為單側(cè)型PA,7例為女性,1例為男性,年齡明顯小于野生型(44.3±6.2 vs 51.9±8.6歲,P0.05),兩組間SBP、DBP、PRA、PAC、血鉀、24小時(shí)尿鉀、ARR及腫瘤直徑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)血漿18-OHF濃度與基因突變的關(guān)系:(1)KCNJ5基因突變患者的血漿18-OHF濃度明顯高于野生型[1.95(1.19,2.70)vs 0.73(0.42,1.41)ng/mL,P=0.034];(2)CACNA1D基因突變患者的血漿18-OHF濃度與野生型相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[0.59(0.32,2.70)vs1.15(0.60,2.16)ng/mL,P=0.516];(3)以血漿18-OHF1.74ng/mL為切點(diǎn),將患者分為高18-OHF組與低18-OHF組,KCNJ5突變?cè)诟?8-OHF患者中的比例明顯高于低18-OHF患者(58.3%vs 18.2%,P=0.017)。而CACNA1D突變比例在兩組間無(wú)明顯差異(25.0%vs 22.7%,P=1.0)。結(jié)論:1.本研究成功建立了LC-MS/MS測(cè)定血漿18-OHF濃度的方法,具有較好的靈敏度及專屬性,能夠?qū)ρ獫{18-OHF進(jìn)行絕對(duì)定量,樣本制備重復(fù)性好,數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠,為進(jìn)一步開(kāi)展后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。2.血漿18-OHF濃度在單側(cè)型PA患者中明顯高于雙側(cè)型PA患者;與金標(biāo)準(zhǔn)AVS相比,血漿18-OHF對(duì)單側(cè)型PA具有一定的診斷價(jià)值,但由于樣本量小,還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步在PA患者中驗(yàn)證。3.35例PA患者中發(fā)現(xiàn)KCNJ5基因G151R、L168R突變率為31.4%,CACNA1D基因rs117630105 C/T突變率為22.9%;未發(fā)現(xiàn)ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1突變。4.血漿18-OHF濃度的升高與KCNJ5基因突變有關(guān),未發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)與CACNA1D基因突變存在相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R586.24
【部分圖文】：

前 言系，還與患者的預(yù)后關(guān)系非常密切，早期識(shí)別 KCNJ5 突變型 APA 患者意義重大由于 IHA 的治療方式首選藥物治療，腎上腺組織標(biāo)本不易獲取，以往針對(duì) IHA 腎上腺增生組織體細(xì)胞突變的研究較少，其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。不過(guò)，近年的研究在 IHA 方面也取得了一定的進(jìn)展。Yamazaki Y 等人[72]發(fā)現(xiàn)在 CT 陰性（提示腎上腺增生或微腺瘤）的 PA 患者腎上腺組織中發(fā)現(xiàn) L-型電壓依賴性鈣離子通道α1亞基（CACNA1D）基因突變率高達(dá) 65%。近期發(fā)表在 Hypertension 雜志的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在 15 例 IHA 患者腎上腺增生組織中發(fā)現(xiàn)在用 CYP11B2 標(biāo)記的醛固酮分泌細(xì)胞簇（aldosterone-producing cell clusters, APCC）區(qū)域中檢測(cè)到的 CACNA1D 變異率高達(dá) 58%，提示不同的體細(xì)胞突變參與了不同亞型 PA 的發(fā)生發(fā)展[73]。

圖 1-1 空白溶液 XIC 圖譜Fig. 1-1 blank solution XIC spectrum圖 1-2 25ng/mL18-OHF 標(biāo)準(zhǔn)品加入 IS 的 XIC 圖譜Fig. 1-2 XIC spectrum of 25ng/mL 18-OHF standard reagent added to IS

建立的色譜-質(zhì)譜方法能檢測(cè)到 18-OHF，并且 18-OHF 和 IS 色譜分離，峰形及專屬性較好。圖 1-1 空白溶液 XIC 圖譜Fig. 1-1 blank solution XIC spectrum

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本文編號(hào)：2819982