研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率、死亡率居高不下及發(fā)病年齡趨于年輕化使其已成為21世紀全球性的疾病威脅。持續(xù)性血糖異常升高及胰島失代償是糖尿病發(fā)生的最重要因素。已有的研究表明,胰島β細胞數目減少和(或)功能障礙是胰島功能難以代償的重要原因。因此,探究胰島β細胞損傷機制將成為糖尿病研究的重中之重。凋亡和自噬是細胞為維持機體穩(wěn)態(tài)而進行的自發(fā)性死亡過程。適度凋亡和自噬對維持胰島β細胞數目具有重要意義。然而,有研究證實,凋亡及自噬的過度激活會誘導細胞死亡。作為人體內重要的體液調節(jié)系統(tǒng)之一,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system,RAS)參與了糖尿病的病理進程。有研究報道,胰腺組織局部RAS系統(tǒng)的激活,特別是Ang Ⅱ的激活,會抑制糖的轉運、降低胰島素分泌及誘導胰島β細胞凋亡。糖尿病臨床資料的數據顯示,2型糖尿病患者血清中存在類AngⅡ的物質-血管緊張素Ⅱ 1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody,AT1-AA)。該抗體首次在1999年被Wallukat等人發(fā)現(xiàn)于子癇前期孕婦血清中,之后人們在多種疾病中均發(fā)現(xiàn)了AT1-AA的存在。研究AT1-AA的作用機制發(fā)現(xiàn),它可以激活血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1receptor,AT1R)進而發(fā)揮類似Ang Ⅱ的作用。因此,存在于糖尿病患者血清中的AT1-AA在糖尿病的病程中,尤其是在胰島細胞損傷中或可發(fā)揮著一定的作用。目的:根據以上研究背景,本課題擬利用AT1-AA陽性大鼠模型研究以下問題:1.AT1-AA長期存在是否能引起血糖及胰島結構和功能改變從而使糖尿病易感性增加;2.AT1-AA對胰島β細胞凋亡及自噬的影響,及自噬在凋亡中的作用。方法:1.動物模型建立:AT1-AA免疫組(Immunized group,n=10):用AT1R-ECⅡ肽段主動免疫大鼠;溶劑對照組(Vehicle group,n=10):用等量抗原稀釋液(Na_2CO_3溶液和生理鹽水)代替抗原溶液。2.親和層析柱分離純化含AT1-AA的IgGs。3.SA-ELISA法檢測血清中AT1-AA滴度。4.OGTT試驗對大鼠免疫過程中葡萄糖耐量進行檢測。5.Immunohistochemistry法觀察胰島組織形態(tài)結構的變化,胰島素分泌情況及自噬相關蛋白的水平。6.本文用Western blot法檢測了凋亡相關蛋白cleaved caspase 3、caspase 3及自噬指示蛋白LC3、beclin 1、P62的表達情況。7.細胞免疫熒光法檢測AT1-AA的特異性。8.Flow cytometry檢測AT1-AA孵育后細胞凋亡。結果:1.AT1-AA陽性大鼠模型建立成功SA-ELISA法檢測大鼠血清中AT1-AA滴度,結果顯示:免疫2W后,免疫組大鼠AT1-AA呈陽性(P0.05),免疫至8W后達到峰值,明顯高于同期對照組(P0.05),之后抗體均保持在較高水平(如圖1A所示)。SDS-PAGE凝膠電泳檢測其純度,結果觀察到,凝膠上呈現(xiàn)兩條清晰的條帶,即IgG重鏈、IgG輕鏈(如圖1B所示)。2.AT1-AA陽性大鼠胰島結構和功能障礙免疫4W之后,AT1-AA免疫組與溶劑對照組的空腹血糖水平無顯著差異(P0.05);免疫至8W,與同期對照組相比,AT1-AA陽性大鼠空腹血糖明顯升高(P0.05)(如圖2A所示)。OGTT試驗監(jiān)測大鼠糖耐量變化,結果顯示,主動免疫4W大鼠服糖后2 h血糖降至正常水平,與溶劑對照組結果無差異(P0.05),而主動免疫8W后,大鼠服糖2 h后血糖仍高于7.7mmol/L,提示糖耐量減低(如圖2B所示)。除此之外,免疫組化結果觀察到:免疫組大鼠胰島結構排列紊亂,可見淋巴細胞浸潤,胰島素分泌減少(如圖2C所示)。以上結果均提示免疫后大鼠糖代謝異常,胰島結構和功能受損。3.AT1-AA陽性大鼠胰島組織凋亡和自噬水平升高分別用Western blot方法及Immumohistochemical stainning對大鼠胰島組織凋亡及自噬水平進行檢測,結果顯示:與溶劑對照組相比,免疫4w,8w,12w,16w后,胰島組織cleaved-caspase3/caspase 3比值及LC3、Beclin 1均升高,免疫組化結果示棕色顆粒較多,著色深,而P62表達下降(P0.05),著色淺(如圖3所示),該結果表明免疫后大鼠胰島組織自噬及凋亡水平均升高,胰島細胞受損。4.陽性血清提純的AT1-AA可特異性結合于INS-1胰島β細胞上的AT1R熒光顯微鏡下觀察到呈現(xiàn)紅色熒光的AT1-AA與呈現(xiàn)綠色熒光的AT1R的細胞定位結果一致,而Negative-Ig G組未觀察到細胞膜上有紅色熒光(如圖4所示)。該結果證明,陽性血清提純的AT1-AA為膜抗體,可特異性地結合于AT1R。5.AT1-AA可降低INS-1胰島β細胞的存活率,且呈濃度依賴性分別用不同濃度(10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~-55 mol/L)的AT1-AA或陰性IgG孵育INS-1胰島β細胞24 h,CCK8法檢測細胞存活率。結果顯示AT1-AA孵育后的細胞存活率呈濃度依賴性地降低。當處理濃度為10~(-6)、10~-55 mol/L時,AT1-AA組存活率較陰性IgG組顯著降低(P0.05)(如圖5所示),我們選用10~-66 mol/L作為后期實驗的處理濃度。6.AT1-AA誘導INS-1胰島β細胞凋亡,且可被AT1R拮抗劑所阻滯細胞凋亡檢測結果顯示,與陰性IgG對照組相比,AT1-AA處理12 h后,細胞凋亡比率明顯升高(P0.05),24 h達到峰值,36 h仍高于對照組(如圖6A所示)。用20μmol/L替米沙坦預處理細胞之后再給予AT1-AA共孵育24 h,Western blot結果顯示AT1-AA誘導細胞凋亡的效應可被阻滯(如圖6B所示)。7.AT1-AA可引起INS-1細胞自噬水平升高,該效應可被AT1R拮抗劑所阻斷用10~(-6) mol/L的AT1-AA分別孵育INS-1細胞6 h、12 h、24 h、36 h后,用Western blot法檢測LC3、beclin1、P62的蛋白水平。結果顯示AT1-AA孵育6 h后,相對于陰性IgG組,LC3、Beclin 1的蛋白水平開始升高,12 h繼續(xù)升高,24 h持續(xù)升高到36 h(P0.05),而P62的蛋白水平逐漸降低(如圖7A所示)。以上結果表明,AT1-AA可引起INS-1胰島細胞自噬水平升高,且呈時間依賴性。用替米沙坦預處理細胞之后,AT1-AA誘導細胞自噬升高的效應亦可被阻滯(如圖7B所示)。8.升高或降低自噬可以明顯改變AT1-AA誘導的細胞凋亡用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或Rapamycin預處理細胞后,再給予AT1-AA孵育細胞24 h。結果顯示,與AT1-AA組相比,抑制自噬后,cleaved caspase 3/caspase3比值下調;而上調自噬后,cleaved caspase 3/caspase3比值上調(P0.05)(如圖8所示)。結論:1.AT1-AA長期存在可誘導胰島組織結構紊亂及分泌胰島素功能障礙;2.AT1-AA可誘導胰島β細胞自噬和凋亡升高,自噬上調可能是AT1-AA誘導胰島β細胞凋亡的原因之一。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

動物模型建立成功A:兩組大鼠血清中抗體滴度水平

陽性大鼠胰島功能障礙A:大鼠空腹血糖水平；B:大鼠葡萄糖耐量試驗

26圖 3 陽性大鼠胰島細胞損傷 A:大鼠胰島自噬相關蛋白表達水平；B:自噬相關蛋白免疫組化染色結果 C :大鼠胰島組織凋亡蛋白表達水平*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle group, n=6。

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 王靜;王瑾;王娟娟;張煒芳;焦向英;;自噬在TXNIP過表達誘導的INS-1胰島細胞凋亡中的作用[J];生理學報;2017年04期

2 張倩;梁男男;吳向征;王瑾;趙嘉惠;焦向英;;軟脂酸對INS-1胰島細胞TXNIP表達的影響[J];中國病理生理雜志;2017年05期

3 趙冬冬;楊沛霖;段佳慧;林樹梅;;胰島β細胞系研究概況[J];動物醫(yī)學進展;2017年03期

4 趙林雙;廖玉華;向光大;王敏;樂嶺;周子華;孫慧伶;譚學瑩;白偉偉;;2型糖尿病患者G蛋白偶聯(lián)型β1和血管緊張素II1受體抗體與冠心病關系的研究[J];中國糖尿病雜志;2013年04期

本文編號：2819714