研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率、死亡率居高不下及發(fā)病年齡趨于年輕化使其已成為21世紀(jì)全球性的疾病威脅。持續(xù)性血糖異常升高及胰島失代償是糖尿病發(fā)生的最重要因素。已有的研究表明,胰島β細(xì)胞數(shù)目減少和(或)功能障礙是胰島功能難以代償?shù)闹匾�。因�?探究胰島β細(xì)胞損傷機(jī)制將成為糖尿病研究的重中之重。凋亡和自噬是細(xì)胞為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)而進(jìn)行的自發(fā)性死亡過程。適度凋亡和自噬對(duì)維持胰島β細(xì)胞數(shù)目具有重要意義。然而,有研究證實(shí),凋亡及自噬的過度激活會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。作為人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system,RAS)參與了糖尿病的病理進(jìn)程。有研究報(bào)道,胰腺組織局部RAS系統(tǒng)的激活,特別是Ang Ⅱ的激活,會(huì)抑制糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、降低胰島素分泌及誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。糖尿病臨床資料的數(shù)據(jù)顯示,2型糖尿病患者血清中存在類AngⅡ的物質(zhì)-血管緊張素Ⅱ 1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody,AT1-AA)。該抗體首次在1999年被Wallukat等人發(fā)現(xiàn)于子癇前期孕婦血清中,之后人們?cè)诙喾N疾病中均發(fā)現(xiàn)了AT1-AA的存在。研究AT1-AA的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn),它可以激活血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1receptor,AT1R)進(jìn)而發(fā)揮類似Ang Ⅱ的作用。因此,存在于糖尿病患者血清中的AT1-AA在糖尿病的病程中,尤其是在胰島細(xì)胞損傷中或可發(fā)揮著一定的作用。目的:根據(jù)以上研究背景,本課題擬利用AT1-AA陽性大鼠模型研究以下問題:1.AT1-AA長(zhǎng)期存在是否能引起血糖及胰島結(jié)構(gòu)和功能改變從而使糖尿病易感性增加;2.AT1-AA對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡及自噬的影響,及自噬在凋亡中的作用。方法:1.動(dòng)物模型建立:AT1-AA免疫組(Immunized group,n=10):用AT1R-ECⅡ肽段主動(dòng)免疫大鼠;溶劑對(duì)照組(Vehicle group,n=10):用等量抗原稀釋液(Na_2CO_3溶液和生理鹽水)代替抗原溶液。2.親和層析柱分離純化含AT1-AA的IgGs。3.SA-ELISA法檢測(cè)血清中AT1-AA滴度。4.OGTT試驗(yàn)對(duì)大鼠免疫過程中葡萄糖耐量進(jìn)行檢測(cè)。5.Immunohistochemistry法觀察胰島組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,胰島素分泌情況及自噬相關(guān)蛋白的水平。6.本文用Western blot法檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase 3、caspase 3及自噬指示蛋白LC3、beclin 1、P62的表達(dá)情況。7.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)AT1-AA的特異性。8.Flow cytometry檢測(cè)AT1-AA孵育后細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1.AT1-AA陽性大鼠模型建立成功SA-ELISA法檢測(cè)大鼠血清中AT1-AA滴度,結(jié)果顯示:免疫2W后,免疫組大鼠AT1-AA呈陽性(P0.05),免疫至8W后達(dá)到峰值,明顯高于同期對(duì)照組(P0.05),之后抗體均保持在較高水平(如圖1A所示)。SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)其純度,結(jié)果觀察到,凝膠上呈現(xiàn)兩條清晰的條帶,即IgG重鏈、IgG輕鏈(如圖1B所示)。2.AT1-AA陽性大鼠胰島結(jié)構(gòu)和功能障礙免疫4W之后,AT1-AA免疫組與溶劑對(duì)照組的空腹血糖水平無顯著差異(P0.05);免疫至8W,與同期對(duì)照組相比,AT1-AA陽性大鼠空腹血糖明顯升高(P0.05)(如圖2A所示)。OGTT試驗(yàn)監(jiān)測(cè)大鼠糖耐量變化,結(jié)果顯示,主動(dòng)免疫4W大鼠服糖后2 h血糖降至正常水平,與溶劑對(duì)照組結(jié)果無差異(P0.05),而主動(dòng)免疫8W后,大鼠服糖2 h后血糖仍高于7.7mmol/L,提示糖耐量減低(如圖2B所示)。除此之外,免疫組化結(jié)果觀察到:免疫組大鼠胰島結(jié)構(gòu)排列紊亂,可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),胰島素分泌減少(如圖2C所示)。以上結(jié)果均提示免疫后大鼠糖代謝異常,胰島結(jié)構(gòu)和功能受損。3.AT1-AA陽性大鼠胰島組織凋亡和自噬水平升高分別用Western blot方法及Immumohistochemical stainning對(duì)大鼠胰島組織凋亡及自噬水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:與溶劑對(duì)照組相比,免疫4w,8w,12w,16w后,胰島組織cleaved-caspase3/caspase 3比值及LC3、Beclin 1均升高,免疫組化結(jié)果示棕色顆粒較多,著色深,而P62表達(dá)下降(P0.05),著色淺(如圖3所示),該結(jié)果表明免疫后大鼠胰島組織自噬及凋亡水平均升高,胰島細(xì)胞受損。4.陽性血清提純的AT1-AA可特異性結(jié)合于INS-1胰島β細(xì)胞上的AT1R熒光顯微鏡下觀察到呈現(xiàn)紅色熒光的AT1-AA與呈現(xiàn)綠色熒光的AT1R的細(xì)胞定位結(jié)果一致,而Negative-Ig G組未觀察到細(xì)胞膜上有紅色熒光(如圖4所示)。該結(jié)果證明,陽性血清提純的AT1-AA為膜抗體,可特異性地結(jié)合于AT1R。5.AT1-AA可降低INS-1胰島β細(xì)胞的存活率,且呈濃度依賴性分別用不同濃度(10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~-55 mol/L)的AT1-AA或陰性IgG孵育INS-1胰島β細(xì)胞24 h,CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示AT1-AA孵育后的細(xì)胞存活率呈濃度依賴性地降低。當(dāng)處理濃度為10~(-6)、10~-55 mol/L時(shí),AT1-AA組存活率較陰性IgG組顯著降低(P0.05)(如圖5所示),我們選用10~-66 mol/L作為后期實(shí)驗(yàn)的處理濃度。6.AT1-AA誘導(dǎo)INS-1胰島β細(xì)胞凋亡,且可被AT1R拮抗劑所阻滯細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性IgG對(duì)照組相比,AT1-AA處理12 h后,細(xì)胞凋亡比率明顯升高(P0.05),24 h達(dá)到峰值,36 h仍高于對(duì)照組(如圖6A所示)。用20μmol/L替米沙坦預(yù)處理細(xì)胞之后再給予AT1-AA共孵育24 h,Western blot結(jié)果顯示AT1-AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)可被阻滯(如圖6B所示)。7.AT1-AA可引起INS-1細(xì)胞自噬水平升高,該效應(yīng)可被AT1R拮抗劑所阻斷用10~(-6) mol/L的AT1-AA分別孵育INS-1細(xì)胞6 h、12 h、24 h、36 h后,用Western blot法檢測(cè)LC3、beclin1、P62的蛋白水平。結(jié)果顯示AT1-AA孵育6 h后,相對(duì)于陰性IgG組,LC3、Beclin 1的蛋白水平開始升高,12 h繼續(xù)升高,24 h持續(xù)升高到36 h(P0.05),而P62的蛋白水平逐漸降低(如圖7A所示)。以上結(jié)果表明,AT1-AA可引起INS-1胰島細(xì)胞自噬水平升高,且呈時(shí)間依賴性。用替米沙坦預(yù)處理細(xì)胞之后,AT1-AA誘導(dǎo)細(xì)胞自噬升高的效應(yīng)亦可被阻滯(如圖7B所示)。8.升高或降低自噬可以明顯改變AT1-AA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或Rapamycin預(yù)處理細(xì)胞后,再給予AT1-AA孵育細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示,與AT1-AA組相比,抑制自噬后,cleaved caspase 3/caspase3比值下調(diào);而上調(diào)自噬后,cleaved caspase 3/caspase3比值上調(diào)(P0.05)(如圖8所示)。結(jié)論:1.AT1-AA長(zhǎng)期存在可誘導(dǎo)胰島組織結(jié)構(gòu)紊亂及分泌胰島素功能障礙;2.AT1-AA可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞自噬和凋亡升高,自噬上調(diào)可能是AT1-AA誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的原因之一。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

動(dòng)物模型建立成功A:兩組大鼠血清中抗體滴度水平

陽性大鼠胰島功能障礙A:大鼠空腹血糖水平；B:大鼠葡萄糖耐量試驗(yàn)

26圖 3 陽性大鼠胰島細(xì)胞損傷 A:大鼠胰島自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平；B:自噬相關(guān)蛋白免疫組化染色結(jié)果 C :大鼠胰島組織凋亡蛋白表達(dá)水平*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle group, n=6。

【參考文獻(xiàn)】

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1 王靜;王瑾;王娟娟;張煒芳;焦向英;;自噬在TXNIP過表達(dá)誘導(dǎo)的INS-1胰島細(xì)胞凋亡中的作用[J];生理學(xué)報(bào);2017年04期

2 張倩;梁男男;吳向征;王瑾;趙嘉惠;焦向英;;軟脂酸對(duì)INS-1胰島細(xì)胞TXNIP表達(dá)的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;2017年05期

3 趙冬冬;楊沛霖;段佳慧;林樹梅;;胰島β細(xì)胞系研究概況[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年03期

4 趙林雙;廖玉華;向光大;王敏;樂嶺;周子華;孫慧伶;譚學(xué)瑩;白偉偉;;2型糖尿病患者G蛋白偶聯(lián)型β1和血管緊張素II1受體抗體與冠心病關(guān)系的研究[J];中國(guó)糖尿病雜志;2013年04期

本文編號(hào)：2819714