研究背景糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成為21世紀嚴重危害人類健康的疾病,根據(jù)2017年國際糖尿病聯(lián)合會發(fā)布的第八版糖尿病地圖數(shù)據(jù)顯示,全球約4.25億成人患糖尿病,而我國糖尿病患者已達到1.198億。胰島β細胞衰竭是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。這種衰竭通常是β細胞的凋亡和功能障礙引起的�，F(xiàn)提出,β細胞身份受損可能是胰島β衰竭另一重要病因。成熟β細胞分化狀態(tài)的喪失是導致β細胞身份受損、最終功能改變的基礎。2016年賈偉平教授等人在一項中國為期9年的前瞻性研究中該下列結(jié)論,即中國人群易患2型糖尿病可能是由于胰島β細胞功能差而非胰島素抵抗。因此,對探討如何改善和恢復胰島β細胞功能對國人來說是至關重要的。同時越來越多的證據(jù)表明,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS,renin-Angiotensin system)的病理性刺激與2型糖尿病相關,并且RAS抑制劑可以延緩新發(fā)2型糖尿病在其高危人群中的發(fā)生。此外,血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為一種強大的RAS成分,它不僅使胰島血流減少,還會引起氧化應激,促炎性細胞因子和胰島纖維化,而且在AngⅡ灌注的糖尿病鼠中發(fā)現(xiàn)胰島β細胞功能障礙。綜前述,既往研究初步揭示了 RAS與2型糖尿病之間的關系,但RAS在糖尿病發(fā)生發(fā)展的深入機制未被完全了解。研究表明β胰島細胞衰竭可主要通過以下機制:氧化應激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,低氧應激以及促炎細胞因子的誘導。在糖尿病小鼠中,β細胞在應對這些應激時,可能去分化即退化成祖細胞的階段或轉(zhuǎn)變成其他類型的胰腺細胞。這些變化導致成熟β細胞身份的喪失。同時,在2型糖尿病患者的胰島中觀察到,β細胞去分化常表現(xiàn)為β細胞自身標志物減少和祖細胞標志物表達增加。因此,近來已經(jīng)認識到完全分化狀態(tài)的喪失是2型糖尿病中潛在的損害β細胞功能的機制。最近臨床試驗和實驗證據(jù)表明,NF-κb是一種主要的轉(zhuǎn)錄因子,能夠正向調(diào)節(jié)1型血管緊張素Ⅱ受體(AT1R)基因的表達。除此之外,RAS抑制劑介導的心臟保護作用與抑制NF-Kb通路介導的炎癥相關。非活化的NF-κb復合物位于細胞質(zhì)中,該復合物包括p65亞基和抑制性IκBα,IκBα可以抑制p65入核,在應激反應中,I1κB激酶(IKK)將抑制性亞基IκBα從復合物釋放出來后,促進p65向細胞核轉(zhuǎn)移,從而引起基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外,在多種不同類型的細胞觀察到,在AngⅡ刺激下能夠引起NF-Kb通路的激活。在以上發(fā)現(xiàn)的基礎上,本研究想探討RAS激活在β細胞去分化過程中是否發(fā)揮重要作用,以及其相關機制。我們選取胰島β細胞系Min6和db/db小鼠分別作為體外、體內(nèi)研究模型,明確RAS系統(tǒng)的激活和胰島β細胞去分化的關系,及研究阻斷RAS或NF-Kb信號通路后,能否有效逆轉(zhuǎn)β細胞去分化,為糖尿病的發(fā)病機制和防治策略提供新的理論依據(jù)和思維視角。研究方法1.細胞培養(yǎng)將胰島β細胞系Min6置于RPMI 1640培基中培養(yǎng),并在37℃,95%空氣和5%CO 2培養(yǎng)箱中孵育,當細胞達到70%融合時我們進行后續(xù)實驗。2.實驗動物選用8周齡雄性db/db小鼠和野生型同窩對照(db/m小鼠)購于南京大學模型動物研究中心。3.腹腔葡萄糖耐量檢測將小鼠過夜禁食后,給其腹膜內(nèi)注射202%葡萄糖溶液(1g/kg)。在0,15,30,60和90分鐘五個時間點用血糖儀進行檢測量尾靜脈血液的葡萄糖濃度。同時在0,15,30分鐘從眼框血中采集血液,進行后續(xù)ELISA試劑盒測試胰島素。4.葡萄糖刺激胰島素分泌實驗將細胞置于Krebs-Ringer碳酸氫鹽HEPES(KRBH)緩沖液進行葡萄糖饑餓準備45分鐘。然后,將其孵育在含有3mM葡萄糖KRBH緩沖液60分鐘,最后將其置于含有25mM葡萄糖KRBH緩沖液中60分鐘。收集孵育過的培養(yǎng)基進行ELISA分析。5.酶聯(lián)免疫吸附試驗然后使用相應的特異性ELISA試劑盒測定培養(yǎng)基和血清的胰島素或IL6。使用酶標儀在450nm處讀取吸光度。6.實時聚合酶鏈式反應使用2-△△Ct方法通過相對基因表達來確定基因表達。7.蛋白印記Western印跡和免疫組織化學十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡如前所述,使用下列抗體一抗針對FoxO1,Pdx-1,Ngn3,磷酸化IλBα(p-IκBα),IκBα,磷酸化p65(p-p65),p65,β-actin和HRP標記的二抗山羊抗兔IgG和二抗山羊抗小鼠IgG。8.免疫熒光分析對胰腺β細胞和固定蠟包埋的胰腺切片(Smm)進行如下的免疫染色。用Nikon Y-TV55熒光顯微鏡捕獲雙重染色的圖像。使用Image-Pro分析儀軟件測量陽性染色面積占總的胰島面積的比例。9.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為均數(shù)士標準誤差,使用Prism7.0進行統(tǒng)計學分析。對于不同實驗組的統(tǒng)計學意義,我們采用單因素或雙因素方差分析(ANOVA),P0.05表示有統(tǒng)計學差異結(jié)果1.RAS抑制劑對葡萄糖誘導的胰島β細胞株身份損害的保護作用葡萄糖毒性誘導的β細胞身份的損傷主要表現(xiàn)為:β細胞自身標記物Pdx1,Ins1下調(diào),以及祖細胞標記物Ngn3,Oct4升高和及β細胞功能障礙,胰島素分泌減少。Irbesartan可部分恢復GSIS水平以及抑制去分化,說明了 RAS抑制劑對葡萄糖誘導的胰島β細胞株身份損害的保護作用。2.AngⅡ?qū)σ葝uβ細胞株的去分化作用和NF-Kb信號通路的關系AngⅡ?qū)Ζ录毎挠泻ψ饔靡蕾囉贜F-κb信號傳導。我們發(fā)現(xiàn)NF-κb通路抑制劑,sc-514也能顯著降低Ngn3,Oct4,IL6mRNA,恢復β細胞身份。AngⅡ誘導NF-κb的激活,導致β細胞的去分化和功能障礙,且干預劑量與NF-Kb通路mRNA水平和蛋白水平正相關,也與β細胞身份損害程度正相關。3.sc-514和Irbesartan對AngⅡ灌注的db/db小鼠的胰島β細胞的作用AngⅡ加劇了 db/db小鼠體內(nèi)胰島β細胞的去分化,而Irbesartan能夠挽救β細胞insulin表達的損失,恢復β細胞的自身身份Pdx1表達,從而改善胰島細胞功能。NF-κb通路抑制劑,sc-514的保護作用主要通過減少祖細胞標記物Ngn3的表達,從而逆轉(zhuǎn)β細胞去分化,并達到最終來改善β細胞分泌功能。結(jié)論本研究首次發(fā)現(xiàn)RAS可能通過作用于血管緊張素受體1(AT1R),誘導NF-Kb信號通路的激活誘導β細胞去分化。因此,阻斷RAS或NF-Kb信號有效地逆轉(zhuǎn)β細胞的去分化狀態(tài),為2型糖尿病患者提供的潛在治療手段。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

低抑制邋Ｎｇｎ３，Ｏｃｔ４，ＩＬ６ｍＲＮＡ邋（３．７４＋１．１４邋ｖｓ邋２．５３＋邋０．２１，１．８９＋邋０．１邋ｖｓ邋０．８邋＋逡逑０．３，１．９６邋＋邋０．３４邋ｖｓ２．１２邋＋邋０．１７）差異具有統(tǒng)計學意義。說明Ａｎｇｌｌ對０細胞的去逡逑分化損傷作用可能依賴于ＮＦ－Ｋｂ通路的激活。（圖２－１及表２－１）逡逑ｇ邋＿邋＊＊＊邋＊＊＊邐２邋５１邋＊＊邋＊＊＊邐ｇ邋＊＊邐＊逡逑＊＊＊邐＊＊＊邐ｉｔ逡逑Ｉ邐Ｔ邐１邋２０＇邐Ａ邐１：６－邐Ｔ逡逑Ｉｆ４．邋１邐｜ｆ１５邐｜１逡逑ｘｌ邐泛邐ＩＩ１５－邐今邐＾邋８邐Ｘ逡逑？邋８邐＜１＞邋８邐Ｔ邐0）邋＞３邋４邋－逡逑Ｃ邋ｏ邐ｆＸｊ邋N邐Ｃ邋藝邋１邋ｏ邋－N邋Ｔ邋Ｔ邋Ｔ邐ｃ邋Ｐ逡逑２－邐ｒｉ邐ｆ１］N邋Ａ逡逑ｃ邋－邐２邋匕邐３邐２－邐．Ｘ．逡逑ｚ邐Ｑ邋０．５－邐ｉ邋Ｉ邐ｄ逡逑。．丨ＱＤＩＪ１Ｊ１Ｊ邐。。１丨」丨‘丨［丨丨，丨１丨邐0ｌｐｌ？ｌｌ，ｌｌＪｌ｜－逡逑Ａｎｇｌｌ邐Ａｎｇｌｌ邐Ａｎｇｌｌ逡逑圖２－１邋ｑＰＣＲ檢測Ｍｈｉ６細胞去分化標記物Ｎｇｎ３、Ｏｃｔ４邋ｍＲＮＡ、炎癥因子ＩＬ６的改變逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋ｑＰＣＲ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ邋ｌｉｋｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋Ｎｇｎ３＞邋Ｏｃｔ４，邋ａｎｄ邋ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｍｔｏｒｙ逡逑ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ＩＬ６邋ｉｎ邋Ｍｉｎ６邋ｃｅｌｌｓ．逡逑上述⑴組Ｍｉｎ６細胞Ｎｇｎ３、Ｏｃｔ４、ＩＬ６邋ｍＲＮＡ的表達，其表達水平標準化處理后為對照逡逑組的倍數(shù)。采用ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ分析數(shù)據(jù)

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 傅飛還;陳剛;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與2型糖尿病[J];醫(yī)學綜述;2008年03期

本文編號：2819396