研究背景隨著人們生活水平的提高,飲食結構發(fā)生了重大的變化,逐漸向西方飲食轉變。西方飲食(Western Diet),富含高飽和脂肪酸和膽固醇,缺少維生素與膳食纖維。最新的《中國居民營養(yǎng)與健康現(xiàn)狀》指出,膳食高能量、高脂肪攝入和缺乏運動與超重、肥胖、糖尿病及血脂異常的發(fā)生密切相關。脂肪(FAT)的攝入,尤其是飽和反式脂肪酸,與肥胖,糖尿病和心血管疾病(CVD,Cardiovascular Disease)的風險增加有關[1]。在人體實驗中,發(fā)現(xiàn)即使是25%-35%的脂肪能量占總熱量比,就會引起脂肪組織聚集,尤其在成人中,來自碳水化合物的脂肪新生的比率比較低。這意味著大多數(shù)的體內(nèi)脂質(zhì)的聚集是來自于飲食[2]。有研究指出,飲食中FA攝入量的增加,將對心臟酯化脂肪酸池的大小和脂肪酸的組成產(chǎn)生影響。隨著FA的攝取增加,心肌細胞內(nèi)TG(甘油三酯)含量也會明顯增加。心肌細胞內(nèi)TG含量被認為是脂毒性的評價指標。盡管如此,心肌內(nèi)TG含量升高和心功能變化之間的潛在的分子機制知之甚少。不像其他組織細胞,心肌細胞主要依賴FFA(游離脂肪酸)的氧化供能,以生成ATP維持心肌細胞不停地收縮。線粒體在這個過程中起主要作用。然而慢性暴露于過量的脂肪酸又可能導致線粒體功能障礙和心力衰竭。以往的研究多集中在,脂質(zhì)聚集引起ROS(活性氧)的釋放,使線粒體容易受到ROS的損傷而引發(fā)線粒體參與的細胞凋亡過程。線粒體的質(zhì)量控制在維持正常的心臟功能中起著關鍵作用。線粒體的動力學,包括線粒體分裂和線粒體融合,是心臟的線粒體質(zhì)量控制的主要調(diào)控機制。線粒體動力學不僅是心血管成熟所必須的,而且還與多種CVD密切相關。在CVD中,線粒體的結構和功能都會發(fā)生一系列的改變[3]。那么高脂飲食是否能引起線粒體結構與功能障礙呢?是否是高脂飲食致心功能障礙是通過線粒體的動力學途徑呢?此類研究報道較少。本課題結合以往的臨床實驗和流行病學調(diào)查,提出問題。高脂飲食會導致心肌脂質(zhì)聚集,引起心功能障礙。并評價線粒體功能與結構,闡明線粒體動力學在高脂飲食致大鼠心功能障礙的作用。為進一步探討線粒體動力學障礙促進心血管疾病發(fā)生的分子機制,為從改善能量代謝與改善線粒體動力學的角度為臨床靶向治療心功能障礙疾病提供新思路。目的1、高脂飲食是否會引起心臟脂毒性(包括心臟脂質(zhì)的聚集與心功能評價)。2、在高脂飲食致心功能障礙中線粒體的數(shù)目、形態(tài)與功能是否發(fā)生了變化。3、線粒體動力學是否與心功能障礙有關。研究方法:為了研究高脂飲食對心肌的線粒體功能的影響,40只SD大鼠被隨機分為兩組,(1)正常飲食組(n = 20)飼料含有10%脂肪,70%碳水化合物,20%蛋白質(zhì);(2)高脂飲食組(n = 20)飼料熱量為5.24kcal/g,含有60%脂肪,20%碳水化合物,20%蛋白質(zhì)。造模時間為28周。試驗結束后對心肌脂質(zhì)含量進行測定。運用心臟彩色超聲多普勒對兩組大鼠心功能進行評估。運用超微透射電鏡對線粒體形態(tài)進行評估。運用高效液相色譜分析法對大鼠心肌內(nèi)腺苷酸代謝系統(tǒng)進行評價,線粒體動態(tài)學的相關基因測定使用定量聚合酶鏈反應和免疫印跡法。線粒體蛋白質(zhì)組學分析用以研究高脂飲食對線粒體蛋白組的影響。結果1.高脂飲食引起大鼠心肌脂質(zhì)聚集CON組大鼠心包內(nèi)有少量脂肪,而HFD組大鼠心包內(nèi)脂肪明顯增加,包繞于心尖部及心臟冠脈表面。與CON組(0.33±0.047g)相比,HFD組大鼠PFT重量增加了三倍(0.95±0.102g),差異有統(tǒng)計學意義。(如圖2.F)。HFD組大鼠左心室肌內(nèi)TG含量(45.8 ± 9.3 μmol/μg蛋白)是CON組大鼠心肌內(nèi)TG含量(21.3 ±6.9 μmol/μg蛋白)的兩倍多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與CON組大鼠心肌內(nèi)FFA含量(0.18±0.04 nmol/μg蛋白)相比,HFD組大鼠心肌內(nèi)FFA含量(0.26±0.07 nmol/μg蛋白)增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.高脂飲食引起大鼠心臟結構與功能改變大體觀與組織稱重顯示:與CON組大鼠相比,HFD組大鼠HM(全心質(zhì)量,1130±36.84mg vs 1327±25.62 mg,p0.05)增加,LVM(左心質(zhì)量,943.67±33.29 mg vs 1127.58 ± 30.78 mg,p0.05)增加。用股骨的長度作為校正后,與CON 組相比,HFD 組大鼠 HMI(全心指數(shù),24.77 ± 1.84 mg/mm vs 30.92 ± 1.57 mg/mm)與 LVMI(左心室重量指數(shù),20.49 ± 1.85 mg/mm vs 26.23 ± 2.08 mg/mm)也明顯增大(p0.05)。心臟彩色超聲多普勒顯示:CON組大鼠心臟左室近似橢圓形,室壁厚薄均勻、運動良好,HFD組大鼠心腔擴大,心肌肥厚,運動無力(如圖1.C-D)。統(tǒng)計學分析顯示,與CON組相比,HFD大鼠室間隔厚度(IVSd,2.16± 0.15 vs 2.48 ± 0.08 mm,P0.05))、收縮末期左室內(nèi)徑(LVIDs,3.18 ± 0.32 vs 3.84 ± 0.52 mm,P0.05)、左室后壁厚度(LVPWd,2.10 ±0.10 vs 2.52 ±0.25mm,P0.05)、收縮末期左室后壁厚度(LVPWs,2.82 ±0.36 vs 3.30 ± 0.25 mm,P0.05)增加,射血分數(shù)(EF,82.7 ± 5.3 vs 73.3 ± 2.0%)、短軸縮短率(FS,46.5 ±5.1 vs 37.3 ± 1.7%,P0.05)明顯下降。3.高脂飲食引起大鼠線粒體結構、數(shù)目與功能異常超微透射電鏡下觀察心肌內(nèi)超微結構顯示:CON組大鼠心肌粗肌絲與細肌絲排列規(guī)則,肌節(jié)正常,Z線清楚,肌纖維束旁含有大量線粒體,多呈現(xiàn)圓形或者橢圓形,線粒體雙層膜結構完整,線粒體內(nèi)崤結構清晰完整,崤密度正常;HFD組大鼠,心肌組織內(nèi)粗肌絲與細肌絲排列不清楚,肌節(jié)顯示不清楚,Z線完全消失;線粒體排列無規(guī)律,線粒體雙層膜結構不完整。部分線粒體長度增大,甚至橫跨多個肌節(jié),部分線粒體腫脹明顯,線粒體內(nèi)部嵴稀疏,基質(zhì)顆粒顯著減少,部分線粒體出現(xiàn)崤溶解、斷裂,內(nèi)部出現(xiàn)多個亮區(qū)或空泡。部分線粒體呈現(xiàn)碎片化,結構不完整。HFD組大鼠線粒體DNA拷貝數(shù)(mtDNA copy number)是CON組mtDNA copy number的39.1 ± 6.1%,P0.05),說明HFD組大鼠心肌內(nèi)線粒體的數(shù)目明顯下降。為評價線粒體內(nèi)氧化磷酸化的效率,我們檢測了大鼠左室心肌細胞線粒體內(nèi)的 Complex Ⅰ、Complex Ⅱ、ComplexⅢ(線粒體復合酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和 CS(檸檬酸復合酶)的活性,結果顯示與CON組大鼠相比,HFD組大鼠線粒體內(nèi)ComplexⅠ(19.5 ± 5.1 nmol/min·mgpro vs 6.2 ± 1.3 nmol/min·mgpro,P0.05)、Complex Ⅱ(21.9 ± 4.1 nmol/min·mgpro vs 13 ± 1.4 nmol/min·mgpro,P0.05)、ComplexⅢ(125.3 ± 5.7 nmol/min·mgpro vs 80.0 ± 8.4nmol/min·mgpro,P0.05),和 CS(371.2±38.5 nmol/min·mgprovs244.0±35.0 nmol/min·mgpro,P0.05)的活性下降,差異具有統(tǒng)計學意義。其中尤以Complex Ⅰ活性下降明顯。線粒體復合酶活性下降,氧化磷酸化受損。為檢測高脂飲食對大鼠心肌能量代謝的影響,我們用高效液相色譜分析法(HPLC)分析大鼠心肌內(nèi)ATP(三磷酸腺苷)、ADP(二磷酸腺苷)、AMP(單磷酸腺苷)的含量,并計算AMP/ATP、TAN(總磷酸腺苷)、EC(能荷)。分析結果顯示:與CON組相比,HFD大鼠心肌內(nèi)TAN(5.97±0.34 ug/ml vs 5.11±0.85 ug/ml,P0.05)總量不變,但是 ATP(2.83±0.4 ug/ml vs 1.78±0.45 ug/ml,P0.05)及 ADP(2.50 ± 0.15 ug/ml vs 2.03±0.23 ug/ml,P0.05)含量減少,EC(0.67 ± 0.03 ug/ml vs 0.55 ± 0.05 ug/ml,P0.05)下降;與 CON 組相比,HFD 組 AMP 濃度明顯升高(0.78 ± 0.14 ug/ml vs 1.3 ± 0.36 ug/ml,P0.05),AMP/ATP 顯著提高(0.26± 0.03 vs 0.75 ±0.04,P0.05)。高脂飲食引起心肌細胞總體能量代謝障礙。對線粒體動力學相關基因mRNA檢測顯示:與CON組相比,HFD組大鼠,線粒體融合相關基因MFN2 mRNA、OPA1 mRNA,線粒體分裂相關基因FIS1mRNA表達下降。差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。我們提取左心室心肌全蛋白以及左心室的線粒體,對線粒體動力學相關蛋白進行Western Blot顯示,與CON組大鼠相比,HFD組大鼠線粒體融合相關基因MFN1、MFN2、OPA1蛋白表達下降,線粒體分裂相關蛋白P-DLP、FIS表達增加、DLP表達不變。并且,顯然,在心肌線粒體內(nèi),線粒體融合相關蛋白與線粒體分裂相關蛋白的濃度更高,變化更加明顯。4.高脂飲食使大鼠線粒體蛋白組學發(fā)生了一系列涉及代謝底物、氧化磷酸化相關復合酶、ATP轉運蛋白、線粒體動力學的變化:①能量供應底物相關:脂肪酸氧化相關蛋白表達明顯下降;葡萄糖有氧氧化及糖酵解相關蛋白表達有升高的趨勢;三羧酸循環(huán)相關蛋白表達下降。說明代謝底物由游離脂肪酸轉變?yōu)槠咸烟�。底物的變化也是心功能障礙的一個重要的代謝標志。②氧化磷酸化相關蛋白:線粒體呼吸鏈復合酶I、V的相關亞基表達下降。氧化磷酸化效率下降。③ATP轉運相關蛋白亞基表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)如ADP/ATP轉移酶、電子傳遞黃素蛋白-輔酶Q氧化還原酶、電子轉移黃蛋白亞基α等。④線粒體動力學相關蛋白:線粒體融合相關蛋白MFN2(差異有統(tǒng)計學意義,P0.05)表達下降,MFN1、OPA1表達下降(差異無統(tǒng)計學意義,P0.05);線粒體分裂相關蛋白FIS1表達升高(差異有統(tǒng)計學意義,P0.05)。說明線粒體融合減少,分裂增多,出現(xiàn)了線粒體動力學功能紊亂。結論1、28w的高脂飲食增加了大鼠心包內(nèi)及心肌內(nèi)的TG含量,使大鼠心肌內(nèi)FFA的含量增加,高脂組大鼠出現(xiàn)了心肌重構和心功能下降。2、對于心肌線粒體超微結構的觀察發(fā)現(xiàn),高脂飲組大鼠心肌內(nèi)線粒體的形態(tài)異常和結構損傷;HFD引起心肌線粒體拷貝數(shù)減少;線粒體內(nèi)復合酶I、復合酶Ⅱ、復合酶Ⅲ、檸檬酸合酶活性下降;在總的腺苷酸不變情況下,HFD組大鼠心肌內(nèi)ATP含量減少,能逆向轉化為ATP的ADP含量減少,AMP含量增多,Energy Charge下降,心肌細胞總體能量代謝障礙。HFD組大鼠出現(xiàn)了心肌細胞線粒體結構和功能障礙。3、HFD導致大鼠心肌線粒體動力學功能紊亂,線粒體的融合與分裂動態(tài)平衡被打亂,線粒體質(zhì)和量難以維持,ATP產(chǎn)生不足,能量耗竭,引起心功能障礙。4、線粒體蛋白組學進行研究,發(fā)現(xiàn)在高脂飲食組大鼠中,出現(xiàn)了能量代謝底物的變化,電子傳遞鏈相關蛋白下降;同時發(fā)現(xiàn)線粒體動力學相關蛋白MFN1、MFN2、OPA1表達下降,FIS1升高。線粒體動力學功能紊亂,線粒體正常的結構與數(shù)目難以維持。線粒體功能障礙和線粒體動力學受損在高脂誘導的心臟功能障礙中發(fā)揮重要作用,這是一個潛在的心臟疾病的治療目標。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

圖１．高脂飲食對大鼠體重及心臟結構的影響逡逑

圖２．高脂飲食對大鼠心臟結構以及對心包、心肌內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響逡逑

圖３．氋脂飲食對大鼠心肌線粒體超微結構及線粒體腺苷酸線粒體復合酶活性的逡逑影響逡逑

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