發(fā)布時間：2020-09-15 08:22

　　 一、前言老年性和絕經后骨質疏松(原發(fā)性骨質疏松)占骨質疏松的85-90%。目前對原發(fā)性骨質疏松發(fā)病分子機制未完全闡明。全基因組關聯(lián)性分析(genome-wide association study，GWAS)是基于人的基因組學分析的研究,為骨質疏松癥的分子遺傳與發(fā)病機制研究提供了大量素材,課題組在前期工作中將骨質疏松GWASs數據與轉錄組學數據結合,篩選出幽靈蛋白家族成員SPTBN1,可能是骨質疏松發(fā)生的關鍵調控分子。SPTBN1是與肌動蛋白交聯(lián)的骨架蛋白,在癌癥、心臟、腦組織等都被證實具有重要的病理生理功能。但其在成骨細胞、破骨細胞、骨血管形成以及骨質疏松癥發(fā)生中的作用未見報道。因此本文通過在小鼠體內外上調或下調SPTBN1的表達水平,從分子、細胞與整體水平探討SPTBN1在原發(fā)性骨質疏松中的作用及其調控機制,為其治療提供新靶點。二、目的初步探討SPTBN1對原發(fā)性骨質疏松的影響以及對成骨細胞、骨血管的作用及其調控機制。三、材料與方法1、原發(fā)性骨質疏松中SPTBN1表達情況分為老年組(16個月),青年組(3個月),絕經組(去卵巢16周),假手術組,microCT檢測其骨微結構,免疫組化檢測SPTBN1。2、上調或下調SPTBN1后,原發(fā)性骨質疏松小鼠骨微結構、骨內微血管的改變在老年組、絕經組右側股骨骨髓腔注射沉默SPTBN1的病毒(老年SPTBN1沉默組,絕經SPTBN1沉默組)以下調SPTBN1,或過表達SPTBN1的病毒(老年SPTBN1過表達組,絕經SPTBN1過表達組)以上調SPTBN1,左側注射對應的陰性對照病毒(老年陰性對照組,絕經陰性對照組),1個月后microCT、HE染色分析骨微結構,或造影劑灌注microCT分析骨內微血管3D圖像、血管體積分數和數目的改變。ALP/TRAP染色,免疫組化檢測SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn,進行成骨細胞不同分化階段計數分析。3、SPTBN1對成骨細胞數目和分化功能的影響在前成骨細胞系MC3T3-E1中轉染沉默SPTBN1的病毒(SPTBN1沉默組)以下調SPTBN1,或過表達SPTBN1的病毒(SPTBN1過表達組)上調SPTBN1,設立陰性對照組,以及空白對照組,加成骨誘導培養(yǎng)基誘導,CCK8檢測法和免疫印跡檢測SPTBN1、Cycline E1明確增殖活性,流式細胞術和免疫印跡檢測SPTBN1、caspase3明確凋亡情況,ALP和茜素紅染色明確細胞的分化功能。4、SPTBN1抑制骨質疏松的可能機制經過以上2的處理,免疫組化檢測VEGF。經以上3的處理,免疫印跡檢測SPTBN1,Smad3,STAT1,TGF-β,ELISA檢測細胞上清液Cxc19的表達水平。四、結果1、老年組比青年組,絕經組比假手術組,SPTBN1表達水平下降。2、老年SPTBN1沉默組比老年陰性對照組,絕經SPTBN1沉默組比絕經陰性對照組骨密度下降,骨小梁數目減少,間隙增寬。其次,SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn表達減少,ALP染色細胞減少,TRAP染色細胞增多。同時骨內微血管體積分數、血管數目減少,VEGF表達下降。3、老年SPTBN1過表達組比老年陰性對照組,絕經SPTBN1過表達組比絕經陰性對照組骨密度升高,骨小梁數目增多。其次,SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn表達增多,ALP染色細胞增多,TRAP染色細胞減少。同時骨內微血管體積分數、血管數目增多,VEGF表達增多。4、與陰性對照組、空白對照組對比,SPTBN1沉默組細胞生長緩慢,凋亡增多,ALP和茜素紅染色減少。相反,SPTBN1過表達組細胞生長稍加快,凋亡無明顯改變,ALP和茜素紅染色增多。5、SPTBN1沉默組TGF-β、Cxc19表達增多,STAT1、Smad3磷酸化增多,相反的,SPTBN1過表達組TGF-β、Cxc19表達減少,STAT1、Smad3磷酸化減少。五、結論SPTBN1可促進成骨細胞增殖與分化,并促進骨內微血管生成進而抑制骨質疏松,這一過程可能與其調控VEGF、TGF-β/Smad3、STAT1/Cxc19的表達相關。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

逑與發(fā)展。但這一假說需要通過體內、外研究證實，其作用的分子機制也亟需深逡逑入地探討（圖１－３）。逡逑Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋ＢＭＳＣ逡逑（ｉ0３邐Ｎ邐１逡逑＼邐／＼邋！邐＼逡逑＼邋／邐ＳＴＡＴｌ逡逑ＲＵＮＸ＾ＯＳＸ邐、土．邋邐ＶＥＧＦＶＥＧＦＲ逡逑ｉ邐ｉ逡逑Ｃｅｉｌ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋■邋－邐ｊ邋Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ邋卜．邐Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑圖邋１－３邋ＳＰＴＢＮ１邋調節(jié)骨質疏松的機制假說（ＢＭＳＣ：ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｓｔｒｏｍａ逡逑ｃｅｌｌ；ＶＥＣ：ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ）。逡逑圖邋１－３邋Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＳＰＴＢＮ１邋ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ邋ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ逡逑１．４．６邋ＴＧＦ－ｐ／Ｓｍａｄ３信號通路與骨質疏松逡逑轉化生長因子－Ｐ邋（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ，邋ＴＧＦ－Ｐ）和骨形態(tài)發(fā)生蛋逡逑白（ｂｏｎｅ邋ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＢＭＰ）信號傳導在胚胎骨骨各發(fā)育階段和出生后骨逡逑骼穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［７２］。ＴＧＦ－卩和ＢＭＰｓ結合四聚體受體復合物之后將信號逡逑傳導至經典的Ｓｍａｄ依賴性信號傳導途徑（ｃａｎｏｎｉｃａｌ邋Ｓｍａｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ逡逑ｐａｔｈｗａｙ，即ＴＧＦ＿ｐ／ＢＭＰ配體，受體和Ｓｍａｄｓ）和非Ｓｍａｄ依賴性信號傳導途徑逡逑（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ－Ｓｍａｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ，邋ＳＰｐ３８絲裂原活化蛋白激酶逡逑／邋ｐ３８邋ＭＡＰＫ

第二章邋ＳＰＴＢＮ１對小鼠骨微結構的影響小電鉆輕輕扭轉插入脛骨和股骨關節(jié)之間的股骨頂部的髁間窩，突破感取出電鉆。使用微量注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器，貨號７０１邋Ｒ３３Ｇ針頭，貨號ＮＥＥＤＬＥ－３３邋－邋７８０３－０５）。將３３Ｇ骨髓針全部插入），將病毒（５ｕｌＡＡＶ或８ｕｌＳＡＭ或相應的陰性對照病毒，病毒緩慢注入股骨腔中，并停留ｌＯｍｉｎ。緩慢取出注射器以減少回流行封口。所有小鼠右腿注射陽性病毒，左腿注射陰性對照病毒［１３性骨質疏松陰性對照病毒組（老年陰性對照組），老年性骨質疏病毒組（老年ＳＰＴＢＮ１沉默組），老年性骨質疏松過表達ＳＰＴＢＮＳＰＴＢＮ１過表達組），絕經后骨質疏松陰性對照病毒組（絕經陰經后骨質疏松沉默ＳＰＴＢＮ１病毒組（絕經ＳＰＴＢＮ１沉默組），絕表達ＳＰＴＢＮ１病毒組（絕經ＳＰＴＢＮ１過表達組），如圖２－１邋Ａ－Ｂ。逡逑Ａ逡逑

２．３．１．１老年性骨質疏松小鼠模型逡逑自發(fā)性老年性骨質疏松小鼠模型（老年組，１６個月）和對照青年組（青年組，逡逑３個月）的股骨進行活體和離體ＣＴ掃描和ＨＥ染色（圖２－２）。結果顯示老年組逡逑小鼠相較青年組小鼠體型大而肥碩（圖２－２Ａ）。老年組比青年組骨密度明顯下降，逡逑骨小梁數量明顯減少，間隙增寬，結構紊亂，脂肪組織X椂�，老年组有箽J矍沐義舷潁ㄍ煎澹玻玻攏模�。辶x希常峰義

本文編號：2818730