發(fā)布時(shí)間：2020-09-15 08:22

　　 一、前言老年性和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(原發(fā)性骨質(zhì)疏松)占骨質(zhì)疏松的85-90%。目前對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)病分子機(jī)制未完全闡明。全基因組關(guān)聯(lián)性分析(genome-wide association study，GWAS)是基于人的基因組學(xué)分析的研究,為骨質(zhì)疏松癥的分子遺傳與發(fā)病機(jī)制研究提供了大量素材,課題組在前期工作中將骨質(zhì)疏松GWASs數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合,篩選出幽靈蛋白家族成員SPTBN1,可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控分子。SPTBN1是與肌動(dòng)蛋白交聯(lián)的骨架蛋白,在癌癥、心臟、腦組織等都被證實(shí)具有重要的病理生理功能。但其在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨血管形成以及骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中的作用未見(jiàn)報(bào)道。因此本文通過(guò)在小鼠體內(nèi)外上調(diào)或下調(diào)SPTBN1的表達(dá)水平,從分子、細(xì)胞與整體水平探討SPTBN1在原發(fā)性骨質(zhì)疏松中的作用及其調(diào)控機(jī)制,為其治療提供新靶點(diǎn)。二、目的初步探討SPTBN1對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松的影響以及對(duì)成骨細(xì)胞、骨血管的作用及其調(diào)控機(jī)制。三、材料與方法1、原發(fā)性骨質(zhì)疏松中SPTBN1表達(dá)情況分為老年組(16個(gè)月),青年組(3個(gè)月),絕經(jīng)組(去卵巢16周),假手術(shù)組,microCT檢測(cè)其骨微結(jié)構(gòu),免疫組化檢測(cè)SPTBN1。2、上調(diào)或下調(diào)SPTBN1后,原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠骨微結(jié)構(gòu)、骨內(nèi)微血管的改變?cè)诶夏杲M、絕經(jīng)組右側(cè)股骨骨髓腔注射沉默SPTBN1的病毒(老年SPTBN1沉默組,絕經(jīng)SPTBN1沉默組)以下調(diào)SPTBN1,或過(guò)表達(dá)SPTBN1的病毒(老年SPTBN1過(guò)表達(dá)組,絕經(jīng)SPTBN1過(guò)表達(dá)組)以上調(diào)SPTBN1,左側(cè)注射對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照病毒(老年陰性對(duì)照組,絕經(jīng)陰性對(duì)照組),1個(gè)月后microCT、HE染色分析骨微結(jié)構(gòu),或造影劑灌注microCT分析骨內(nèi)微血管3D圖像、血管體積分?jǐn)?shù)和數(shù)目的改變。ALP/TRAP染色,免疫組化檢測(cè)SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn,進(jìn)行成骨細(xì)胞不同分化階段計(jì)數(shù)分析。3、SPTBN1對(duì)成骨細(xì)胞數(shù)目和分化功能的影響在前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1中轉(zhuǎn)染沉默SPTBN1的病毒(SPTBN1沉默組)以下調(diào)SPTBN1,或過(guò)表達(dá)SPTBN1的病毒(SPTBN1過(guò)表達(dá)組)上調(diào)SPTBN1,設(shè)立陰性對(duì)照組,以及空白對(duì)照組,加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo),CCK8檢測(cè)法和免疫印跡檢測(cè)SPTBN1、Cycline E1明確增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡檢測(cè)SPTBN1、caspase3明確凋亡情況,ALP和茜素紅染色明確細(xì)胞的分化功能。4、SPTBN1抑制骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制經(jīng)過(guò)以上2的處理,免疫組化檢測(cè)VEGF。經(jīng)以上3的處理,免疫印跡檢測(cè)SPTBN1,Smad3,STAT1,TGF-β,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液Cxc19的表達(dá)水平。四、結(jié)果1、老年組比青年組,絕經(jīng)組比假手術(shù)組,SPTBN1表達(dá)水平下降。2、老年SPTBN1沉默組比老年陰性對(duì)照組,絕經(jīng)SPTBN1沉默組比絕經(jīng)陰性對(duì)照組骨密度下降,骨小梁數(shù)目減少,間隙增寬。其次,SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn表達(dá)減少,ALP染色細(xì)胞減少,TRAP染色細(xì)胞增多。同時(shí)骨內(nèi)微血管體積分?jǐn)?shù)、血管數(shù)目減少,VEGF表達(dá)下降。3、老年SPTBN1過(guò)表達(dá)組比老年陰性對(duì)照組,絕經(jīng)SPTBN1過(guò)表達(dá)組比絕經(jīng)陰性對(duì)照組骨密度升高,骨小梁數(shù)目增多。其次,SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn表達(dá)增多,ALP染色細(xì)胞增多,TRAP染色細(xì)胞減少。同時(shí)骨內(nèi)微血管體積分?jǐn)?shù)、血管數(shù)目增多,VEGF表達(dá)增多。4、與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組對(duì)比,SPTBN1沉默組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,凋亡增多,ALP和茜素紅染色減少。相反,SPTBN1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)稍加快,凋亡無(wú)明顯改變,ALP和茜素紅染色增多。5、SPTBN1沉默組TGF-β、Cxc19表達(dá)增多,STAT1、Smad3磷酸化增多,相反的,SPTBN1過(guò)表達(dá)組TGF-β、Cxc19表達(dá)減少,STAT1、Smad3磷酸化減少。五、結(jié)論SPTBN1可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化,并促進(jìn)骨內(nèi)微血管生成進(jìn)而抑制骨質(zhì)疏松,這一過(guò)程可能與其調(diào)控VEGF、TGF-β/Smad3、STAT1/Cxc19的表達(dá)相關(guān)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

逑與發(fā)展。但這一假說(shuō)需要通過(guò)體內(nèi)、外研究證實(shí)，其作用的分子機(jī)制也亟需深逡逑入地探討（圖１－３）。逡逑Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋ＢＭＳＣ逡逑（ｉ0３邐Ｎ邐１逡逑＼邐／＼邋！邐＼逡逑＼邋／邐ＳＴＡＴｌ逡逑ＲＵＮＸ＾ＯＳＸ邐、土．邋邐ＶＥＧＦＶＥＧＦＲ逡逑ｉ邐ｉ逡逑Ｃｅｉｌ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋■邋－邐ｊ邋Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ邋卜．邐Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑圖邋１－３邋ＳＰＴＢＮ１邋調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松的機(jī)制假說(shuō)（ＢＭＳＣ：ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｓｔｒｏｍａ逡逑ｃｅｌｌ；ＶＥＣ：ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ）。逡逑圖邋１－３邋Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＳＰＴＢＮ１邋ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ邋ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ逡逑１．４．６邋ＴＧＦ－ｐ／Ｓｍａｄ３信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松逡逑轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－Ｐ邋（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ，邋ＴＧＦ－Ｐ）和骨形態(tài)發(fā)生蛋逡逑白（ｂｏｎｅ邋ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＢＭＰ）信號(hào)傳導(dǎo)在胚胎骨骨各發(fā)育階段和出生后骨逡逑骼穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［７２］。ＴＧＦ－卩和ＢＭＰｓ結(jié)合四聚體受體復(fù)合物之后將信號(hào)逡逑傳導(dǎo)至經(jīng)典的Ｓｍａｄ依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑（ｃａｎｏｎｉｃａｌ邋Ｓｍａｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ逡逑ｐａｔｈｗａｙ，即ＴＧＦ＿ｐ／ＢＭＰ配體，受體和Ｓｍａｄｓ）和非Ｓｍａｄ依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑逡逑（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ－Ｓｍａｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ，邋ＳＰｐ３８絲裂原活化蛋白激酶逡逑／邋ｐ３８邋ＭＡＰＫ

第二章邋ＳＰＴＢＮ１對(duì)小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響小電鉆輕輕扭轉(zhuǎn)插入脛骨和股骨關(guān)節(jié)之間的股骨頂部的髁間窩，突破感取出電鉆。使用微量注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器，貨號(hào)７０１邋Ｒ３３Ｇ針頭，貨號(hào)ＮＥＥＤＬＥ－３３邋－邋７８０３－０５）。將３３Ｇ骨髓針全部插入），將病毒（５ｕｌＡＡＶ或８ｕｌＳＡＭ或相應(yīng)的陰性對(duì)照病毒，病毒緩慢注入股骨腔中，并停留ｌＯｍｉｎ。緩慢取出注射器以減少回流行封口。所有小鼠右腿注射陽(yáng)性病毒，左腿注射陰性對(duì)照病毒［１３性骨質(zhì)疏松陰性對(duì)照病毒組（老年陰性對(duì)照組），老年性骨質(zhì)疏病毒組（老年ＳＰＴＢＮ１沉默組），老年性骨質(zhì)疏松過(guò)表達(dá)ＳＰＴＢＮＳＰＴＢＮ１過(guò)表達(dá)組），絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松陰性對(duì)照病毒組（絕經(jīng)陰經(jīng)后骨質(zhì)疏松沉默ＳＰＴＢＮ１病毒組（絕經(jīng)ＳＰＴＢＮ１沉默組），絕表達(dá)ＳＰＴＢＮ１病毒組（絕經(jīng)ＳＰＴＢＮ１過(guò)表達(dá)組），如圖２－１邋Ａ－Ｂ。逡逑Ａ逡逑

２．３．１．１老年性骨質(zhì)疏松小鼠模型逡逑自發(fā)性老年性骨質(zhì)疏松小鼠模型（老年組，１６個(gè)月）和對(duì)照青年組（青年組，逡逑３個(gè)月）的股骨進(jìn)行活體和離體ＣＴ掃描和ＨＥ染色（圖２－２）。結(jié)果顯示老年組逡逑小鼠相較青年組小鼠體型大而肥碩（圖２－２Ａ）。老年組比青年組骨密度明顯下降，逡逑骨小梁數(shù)量明顯減少，間隙增寬，結(jié)構(gòu)紊亂，脂肪組織X椂�，老年组有箽J矍沐義舷潁ㄍ煎澹玻玻攏模�。辶x希常峰義

本文編號(hào)：2818730