發(fā)布時(shí)間：2020-09-11 11:36

　　 【目的】部分Ⅱ型糖尿病患者因其血糖控制不佳,會(huì)導(dǎo)致拔牙創(chuàng)的延遲愈合,而局部炎癥是主要因素之一,但其發(fā)生機(jī)制仍未明確。本研究首先通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定Ⅱ型糖尿病所致的拔牙創(chuàng)延遲愈合現(xiàn)象,并觀察局部炎癥環(huán)境及巨噬細(xì)胞的極化改變,然后通過(guò)體外試驗(yàn)驗(yàn)證不同極化狀態(tài)下的骨髓巨噬細(xì)胞(BMDMs)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化能力的影響,最后以負(fù)載有IL-4的生物支架干預(yù)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)愈合的免疫環(huán)境,本研究為探尋促進(jìn)Ⅱ型糖尿病骨組織再生修復(fù)提供新思路�！痉椒ā竣蛐吞悄虿⌒∈蟀窝绖�(chuàng)愈合過(guò)程及巨噬細(xì)胞特征的研究:(1)以高脂飲食及鏈脲霉素(STZ)聯(lián)合構(gòu)建Ⅱ型糖尿病小鼠動(dòng)物模型;(2)糖尿病動(dòng)物模型構(gòu)建成功后,行拔牙手術(shù),并于術(shù)后7天和28天收集標(biāo)本以備進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析;(3)以影像學(xué)及組織學(xué)方法觀察拔牙創(chuàng)骨愈合效果;(4)以組織免疫學(xué)方法分析拔牙創(chuàng)內(nèi)的成骨分化情況、炎癥環(huán)境及巨噬細(xì)胞的極化改變。巨噬細(xì)胞極化影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的體外實(shí)驗(yàn)研究:(1)分別將M0、M1及M2型巨噬細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)14天;(2)Real-time PCR檢測(cè)共培養(yǎng)體系中BMSCs的成骨分化相關(guān)基因Runx2,ALP,OSX和OCN的表達(dá)變化;(3)ELISA檢測(cè)BMSCs培養(yǎng)上清中的促炎細(xì)胞因子TNF-α及抗炎細(xì)胞因子IL-10的濃度;(4)分別以0、5、10,20ng/ml濃度的TNF-α作用于BMSCs,作用72小時(shí)后,以Western Blot分析成骨分化相關(guān)蛋白OPN、Runx2及OSX的表達(dá)變化。Gelatin/β-TCP緩釋IL-4促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化:(1)合成不同β-TCP含量(0%、25%及50%)的Gelatin/β-TCP支架材料,并負(fù)載IL-4細(xì)胞因子于支架中;(2)選取未負(fù)載IL-4的0%和25%β-TCP含量的Gelatin/β-TCP支架,以掃描電鏡分別觀察其微觀結(jié)構(gòu)并計(jì)算其孔隙率和孔徑大小;(3)將負(fù)載或未負(fù)載IL-4的Gelatin/β-TCP(25%β-TCP含量)支架分別與M0型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),與直接加入IL-4(20 ng/ml)相比較,以Western Blot分析M1和M2型巨噬細(xì)胞的極化指標(biāo)CD86(M1)和CD206(M2)的蛋白表達(dá)變化;(4)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的TNF-α及IL-10的含量。Gelatin/β-TCP緩釋IL-4支架促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)愈合的實(shí)驗(yàn)研究:(1)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙后,即刻將負(fù)載和未負(fù)載IL-4的Gelatin/β-TCP支架(25%β-TCP含量)植入小鼠拔牙窩內(nèi),分別于術(shù)后7天和28天收集標(biāo)本;(2)以影像學(xué)方法觀察拔牙創(chuàng)的骨愈合效果;(3)以組織免疫學(xué)方法分析Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)內(nèi)的成骨分化情況、炎癥環(huán)境及巨噬細(xì)胞的極化改變。【結(jié)果】Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)的骨愈合過(guò)程及巨噬細(xì)胞特征的研究:(1)Ⅱ型糖尿病導(dǎo)致小鼠拔牙創(chuàng)的骨愈合發(fā)生延遲;(2)Ⅱ型糖尿病導(dǎo)致小鼠的拔牙創(chuàng)內(nèi)成骨分化能力減弱;(3)Ⅱ型糖尿病導(dǎo)致小鼠的拔牙創(chuàng)內(nèi)呈現(xiàn)慢性炎癥狀態(tài);(4)Ⅱ型糖尿病導(dǎo)致小鼠的拔牙創(chuàng)內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞大量并長(zhǎng)時(shí)間聚集,M1向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)換發(fā)生顯著延遲。巨噬細(xì)胞極化影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的體外實(shí)驗(yàn)研究:(1)M1型巨噬細(xì)胞抑制BMSCs的成骨分化能力;(2)M1型巨噬細(xì)胞分泌至BMSCs上清中的TNF-α顯著多于M2型巨噬細(xì)胞;(3)M2型巨噬細(xì)胞分泌至BMSCs上清中的IL-10顯著多于M1型巨噬細(xì)胞;(4)在一定劑量和時(shí)效條件下,TNF-α呈現(xiàn)對(duì)BMSCs成骨分化能力的顯著抑制。Gelatin/β-TCP緩釋IL-4促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化:(1)Gelatin/β-TCP可持續(xù)緩慢地釋放IL-4;(2)且在明膠比例及交聯(lián)方式不變的條件下,β-TCP的含量并不影響IL-4在支架中的負(fù)載量;(3)Gelatin/β-TCP釋放的IL-4促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化;(4)Gelatin/β-TCP釋放的IL-4抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化;(5)Gelatin/β-TCP釋放的IL-4促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分泌IL-10;(6)Gelatin/β-TCP釋放的IL-4抑制M1型巨噬細(xì)胞釋放TNF-α。Gelatin/β-TCP緩釋IL-4支架促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)愈合的實(shí)驗(yàn)研究:(1)Gelatin/β-TCP+IL-4支架促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)的愈合;(2)Gelatin/β-TCP+IL-4支架可促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)內(nèi)的成骨分化能力;(3)Gelatin/β-TCP+IL-4支架可緩解Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)內(nèi)的慢性炎癥;(4)Gelatin/β-TCP+IL-4支架可促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)換�！窘Y(jié)論】1.Ⅱ型糖尿病導(dǎo)致小鼠拔牙創(chuàng)內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞大量聚集,引發(fā)慢性炎癥,抑制成骨分化能力,致使拔牙創(chuàng)的骨愈合發(fā)生延遲;2.M1型巨噬細(xì)胞分泌大量的促炎因子TNF-α,并抑制BMSCs成骨分化;3.Gelatin/β-TCP+IL-4支架促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化,抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化;4.Gelatin/β-TCP+IL-4支架促進(jìn)Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙創(chuàng)內(nèi)BMDMs由M1型向M2型的轉(zhuǎn)換,抑制慢性炎癥的發(fā)生,提高拔牙創(chuàng)內(nèi)的成骨分化能力,促進(jìn)拔牙創(chuàng)的骨愈合。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.1;R782.11
【部分圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文2.2 Micro-CT 檢測(cè)結(jié)果分別于術(shù)后 7 天和 28 天進(jìn)行 Miro-CT 檢測(cè)，對(duì)正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的拔牙創(chuàng)在愈合過(guò)程中骨體積分?jǐn)?shù)的變化作定量分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組拔牙創(chuàng)的愈合相較于正常對(duì)照組呈現(xiàn)明顯的延遲（圖1.1A），實(shí)驗(yàn)組拔牙創(chuàng)的骨體積分?jǐn)?shù)明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1.B）

圖 1.2 Masson 染色觀察拔牙創(chuàng)愈合Masson 染色觀察術(shù)后 7 天和 28 天，正常對(duì)照組與Ⅱ型糖尿中牙槽骨的新骨形成情況（Control, 正常對(duì)照組；T2D, Ⅱ型糖尿病組）2.4 免疫組化染色結(jié)果2.4.1 免疫組化觀察分析拔牙創(chuàng)成骨分化能力分別于術(shù)后 7 天和 28 天進(jìn)行免疫組化觀察，對(duì)正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的拔牙創(chuàng)內(nèi)成骨分化指標(biāo) Runx2 和 OCN 的表達(dá)作定量分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：術(shù)后 7 天和 28 天，實(shí)驗(yàn)組拔牙創(chuàng)的愈合相較于正常對(duì)照組，牙槽骨的成骨分化能力呈現(xiàn)明顯減弱, Runx2 和 OCN 的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1.3A, B, C）

圖 1.2 Masson 染色觀察拔牙創(chuàng)愈合Masson 染色觀察術(shù)后 7 天和 28 天，正常對(duì)照組與Ⅱ型糖尿中牙槽骨的新骨形成情況（Control, 正常對(duì)照組；T2D, Ⅱ型糖尿病組）2.4 免疫組化染色結(jié)果2.4.1 免疫組化觀察分析拔牙創(chuàng)成骨分化能力分別于術(shù)后 7 天和 28 天進(jìn)行免疫組化觀察，對(duì)正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的拔牙創(chuàng)內(nèi)成骨分化指標(biāo) Runx2 和 OCN 的表達(dá)作定量分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：術(shù)后 7 天和 28 天，實(shí)驗(yàn)組拔牙創(chuàng)的愈合相較于正常對(duì)照組，牙槽骨的成骨分化能力呈現(xiàn)明顯減弱, Runx2 和 OCN 的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1.3A, B, C）

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