目的:肌成纖維細胞是促進創(chuàng)面愈合的肉芽組織的主要細胞成分,它由成纖維細胞分化而來。成纖維細胞向肌成纖維細胞分化過程中表達的一種具有收縮性的特征性產(chǎn)物——α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是參與傷口修復(fù)和愈合的重要物質(zhì),所以肌成纖維細胞在創(chuàng)面愈合過程中具有更重要的作用。但是關(guān)于糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中肌成纖維細胞的形成情況如何,目前未見相關(guān)研究。本文對糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織和非糖尿病創(chuàng)面肉芽組織在基因和蛋白水平分析肌成纖維細胞相關(guān)特異性蛋白α-SMA的表達情況,并通過分離兩組成纖維細胞進行α-SMA染色,在組織和細胞水平觀察肌成纖維細胞在糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中的生成情況,探討糖尿病足遷延不愈的機制。方法:1經(jīng)過納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的篩選,選取2016年1月到2017年6月于解放軍白求恩國際和平醫(yī)院接受住院治療的糖尿病足患者10例作為實驗組,并選取相同時間段內(nèi)符合入排標(biāo)準(zhǔn)于本院燒傷科住院接受治療的非糖尿病患者10例作為對照組。2兩組受試者于入院后給予常規(guī)換藥處理,并清除壞死組織,隔日一次,時間為10-15天,之后取創(chuàng)面局部新鮮肉芽組織。將肉芽組織分為3份,1份于4%多聚甲醛固定液固定后,行石蠟包埋,用于免疫組化染色。第2份取材后放入液氮使其迅速降溫,然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱低溫保存,進行Western blot和Real-time PCR檢測。第3份進行肌成纖維細胞原代培養(yǎng),然后進行免疫組化染色。3免疫組化處理:對兩組肉芽組織中α-SMA的表達情況進行半定量分析。于光鏡下(400×)觀察呈棕黃色顆粒代表α-SMA染色陽性。在每份染色切片隨機選取10個陽性區(qū)域,拍照并用數(shù)字醫(yī)學(xué)分析系統(tǒng)(MoticMedical 6.0)進行α-SMA的光密度值檢測,用平均光密度值(optical density,OD)對α-SMA的表達情況進行半定量分析。4 Western blot:分析α-SMA在蛋白水平的表達。用Image J軟件分析兩組α-SMA的條帶灰度值,每個條帶中α-SMA的表達量以α-SMA與GAPDH條帶灰度的比值來表示,對α-SMA進行蛋白定量分析。5 Real-time PCR:檢測α-SMA在基因水平的表達情況,即α-SMA mRNA的表達量,對α-SMA進行基因定量分析。6細胞培養(yǎng):將標(biāo)本放入生理鹽水中短暫保存,然后取出,用剪刀剪碎組織塊,用I型膠原酶消化,得到的細胞用“差時貼壁法”分離純化得到成纖維細胞,然后進行原代培養(yǎng),在培養(yǎng)到第3-4天,顯微鏡下觀察,80%以上成纖維細胞伸展開,行細胞固定。7細胞免疫組化染色:對固定的細胞行α-SMA染色,染色陽性的即為肌成纖維細胞。觀察并計算視野中染色陽性的細胞百分比。結(jié)果:1.鏡下觀察免疫組化染色切片:兩組均可見α-SMA表達的棕黃色顆粒,但和對照組相比,實驗組的陽性染色的棕黃色顆粒稀疏,用平均光密度值半定量α-SMA的表達,對α-SMA進行分析,結(jié)果示:實驗組α-SMA的表達量顯著低于對照組(P0.01)。2.兩組肉芽組織Western blot結(jié)果顯示:分別統(tǒng)計實驗組和對照組的α-SMA與GAPDH條帶灰度的比值,對α-SMA的表達進行定量分析。實驗組中α-SMA相對蛋白表達值為0.32±0.09,對照組肉芽組織中α-SMA的相對蛋白表達值為0.58±0.15,實驗組的α-SMA表達量顯著低于對照組(P0.01)。3.Real-time PCR分析結(jié)果:實驗組肉芽組織中α-SMA相對基因表達值是0.83±0.27,對照組中α-SMA的相對基因表達值為1.29±0.30,糖尿病足組肉芽組織的α-SMA mRNA表達低于對照組(P0.01)。4.對成纖維細胞固定后免疫組化染色:高倍視野(400×)觀察,糖尿病足組的α-SMA染色陽性的呈棕黃色的肌成纖維細胞的染色比率明顯少于對照組。結(jié)論:和非糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織相比,糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中肌成纖維細胞的生成明顯減少。由于肌成纖維細胞的減少能夠引起創(chuàng)面局部收縮障礙,推測肌成纖維細胞生成減少可能是糖尿病足愈合困難、遷延不愈的原因之一。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

鏡下觀察糖尿病足組與對照組的組織塊的免疫組織化學(xué)染色切片，均可見代表α-SMA表達陽性的棕黃色、黃褐色的著色顆粒。糖尿病足組棕黃色顆粒稀疏，而對照組的陽性表達的棕黃色顆粒較密集。見圖1所示。統(tǒng)計分析兩組切片的代表α-SMA含量的平均光密度值：糖尿病足組新生肉芽組織中α-SMA的平均光密度值為0.12±0.05，對照組的非糖尿病足部創(chuàng)面肉芽組織的α-SMA平均光密度值為0.39±0.07，見圖2所示。結(jié)果表明：糖尿病足潰瘍?nèi)庋拷M織中α-SMA表達下降。3. Western blot分析α-SMA蛋白表達對兩組肉芽組織中α-SMA蛋白進行Western blot分析。其Western blot曝光膠片見圖3A所示。以GAPDH作為內(nèi)參照蛋白。結(jié)果以α-SMA與GAPDH條帶灰度比值來表示每個條帶的α-SMA的蛋白相對表達含量，糖尿病足組肉芽組織的α-SMA相對蛋白表達值是0.32±0.09，對照組的非糖尿病創(chuàng)面肉芽組織的α-SMA的蛋白相對表達值是0.58±0.15，見圖3B所示。結(jié)果表明：與非糖尿病的創(chuàng)面肉芽組織相比，糖尿病足創(chuàng)面的肉芽組織中α-SMA蛋白表達水平下降。4. Real-time PCR分析α-SMA基因表達用Real-time PCR檢測分析兩組肉芽組織標(biāo)本中α-SMA的基因表達情況，對α-SMA進行基因定量分析。通過計算得到各樣本各目的基因的表達相對定量值

統(tǒng)計分析兩組切片的代表α-SMA含量的平均光密度值：糖尿病足組新生肉芽組織中α-SMA的平均光密度值為0.12±0.05，對照組的非糖尿病足部創(chuàng)面肉芽組織的α-SMA平均光密度值為0.39±0.07，見圖2所示。結(jié)果表明：糖尿病足潰瘍?nèi)庋拷M織中α-SMA表達下降。3. Western blot分析α-SMA蛋白表達對兩組肉芽組織中α-SMA蛋白進行Western blot分析。其Western blot曝光膠片見圖3A所示。以GAPDH作為內(nèi)參照蛋白。結(jié)果以α-SMA與GAPDH條帶灰度比值來表示每個條帶的α-SMA的蛋白相對表達含量，糖尿病足組肉芽組織的α-SMA相對蛋白表達值是0.32±0.09，對照組的非糖尿病創(chuàng)面肉芽組織的α-SMA的蛋白相對表達值是0.58±0.15，見圖3B所示。結(jié)果表明：與非糖尿病的創(chuàng)面肉芽組織相比，糖尿病足創(chuàng)面的肉芽組織中α-SMA蛋白表達水平下降。4. Real-time PCR分析α-SMA基因表達用Real-time PCR檢測分析兩組肉芽組織標(biāo)本中α-SMA的基因表達情況，對α-SMA進行基因定量分析。通過計算得到各樣本各目的基因的表達相對定量值，即RQ值。糖尿病足組肉芽組織中α-SMA的相對基因表達值為0.83±0.27,非糖尿病足組的α-SMA的相對基因表達值為1.29±0.30。見圖4所示。結(jié)果表明：與非糖尿病的組織創(chuàng)面相比，糖尿病足創(chuàng)面肉芽組織中α-SMA基因表達水平下調(diào)。5. 細胞培養(yǎng)結(jié)果在細胞培養(yǎng)至3-4天后顯微鏡下觀察

A B圖 3 A α-SMA 免疫印記條帶; B 兩組α-SMA 的相對蛋白表達量ig.3 A Western blot band of α-SMA; B The relative protein expression ofα-SMA from two groups,Compared with control group, P＜0.01

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 勞國娟;任萌;黃燕瑞;楊川;王曉藝;嚴勵;;糖尿病足傷口皮膚細胞凋亡情況及AGEs對人皮膚成纖維細胞凋亡的影響[J];中國病理生理雜志;2014年08期

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本文編號：2816499