目前全球糖尿病發(fā)病率和患病逐年升高,糖尿病并發(fā)癥嚴重影響糖尿病患者的健康水平,其中糖尿病血管并發(fā)生癥已成為導致糖尿病患者致殘、致死的主要原因。其中,晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)在糖尿病血管病變發(fā)生和發(fā)展中的作用備受關注。晚期糖基化終產(chǎn)物可激活細胞內(nèi)信號通路,引起下游炎癥因子釋放,造成血管內(nèi)皮細胞損傷,但具體信號通路仍有待研究證實。有研究顯示,FTY720(芬戈莫德)可能在糖尿病血管病變治療中具有重要意義。目前在體動物實驗證實FTY720可與血管內(nèi)皮細胞上的1-磷酸鞘氨醇受體1和3相結(jié)合,影響下游信號分子的合成和釋放,從而改善內(nèi)皮細胞功能,保護血管內(nèi)皮細胞。但是FTY720對晚期糖基化終產(chǎn)物誘導血管內(nèi)皮細胞損傷的作用及具體作用機制尚不十分清楚。目的:探究FTY720對晚期糖基化終產(chǎn)物誘導血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用及可能的作用信號通路。方法:體外培養(yǎng)EA.hy926細胞株,實驗分為對照組、AGEs損傷組、FTY720+AGEs組。FTY720+AGEs組用濃度為7.5umol/L的FTY720處理6小時,對照組和AGEs損傷組不加任何試劑同步處置相同時間后,AGEs損傷組、FTY720+AGEs組均加入AGEs(終濃度為200mg/L)誘導細胞損傷,12小時后顯微鏡線觀察細胞形態(tài),用CCK-8法檢測各組細胞活力。采用Griess法檢培養(yǎng)液上清中NO含量,Elisa試劑盒檢測細胞勻漿中IL-6、IL-1β的濃度。Western blot法檢測細胞勻漿中PI3K磷酸化水平。結(jié)果:AO/EB染色顯示,熒光顯維鏡下觀察到,對照物細胞染色質(zhì)呈綠色且結(jié)構正常,細胞形態(tài)呈正常的多角形或梭形,AGEs損傷組,部分細胞染色質(zhì)呈橘紅色、核固縮,細胞腫脹扁圓。FTY720+AGEs組細胞核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀,細胞觸角消失,略變圓。CCK-8法檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,AGEs損傷組和FTY720+AGEs組細胞活力下降(P0.05),與AGEs損傷組相比,FTY720+AGEs組細胞活力升高(P0.05)。Griess、Elisa和Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,AGEs損傷組和FTY720+AGEs組NO、IL-6、IL-1β濃度、PI3K磷酸化水平升高(P0.05)。與AGEs損傷組相比,FTY720+AGEs組NO、IL-6、IL-1β濃度、PI3K磷酸化水平減低(P0.05)。結(jié)論:1、AGEs可通過增強PI3K磷酸化,引起NO、IL-6、IL-1β等物質(zhì)釋放,導致內(nèi)皮細胞損傷。2、FTY720可抑制PI3K磷酸化,減少NO、IL-6、IL-1β等物質(zhì)釋放,從而減輕AGEs引起的內(nèi)皮細胞損傷。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

圖 3.1 各實驗組 AO/EB 染色結(jié)果（各圖片分辨率均為 200）凋亡細胞：熒光顯微鏡下核染色質(zhì)呈橘紅色，細胞腫脹變圓。介于正常和凋亡細胞間細胞。正常細胞：熒光顯微鏡下核染色質(zhì)為綠色，細胞成梭形或多觸角

83.2 CCK-8 法測定細胞活力圖3.3 細胞活力測定（ X ±S，n=6）* 代表與對照組相比，P<0.05； # 代表與AGEs損傷組相比，P<0.05。與對照組相比，AGEs損傷組和FTY720+AGEs組細胞活力減低，P<0.05；與AGEs損傷組相比，F(xiàn)TY720+AGEs組細胞活力升高，P<0.05。

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3.3 Griess 法檢測 NO 含量，Elisa 法測量 IL-6、IL-1β的含量依據(jù)所用Griess試劑盒使用說明，將待測樣品、標準品在540nm的OD值和標準品濃度代入公式：（待測定OD值-空白OD值）/（標準品OD值-空白OD值）×標準品濃度(20umol/L)÷待測樣品蛋白質(zhì)濃度(g/L)，計算得出實際樣品濃度（單位：umol/g）。依據(jù)所用IL-6、IL-1β Elisa試劑盒使用說明，用標準物的濃度和450nm的OD值計算出標準曲線的回歸方程，將待測樣品在450nm的OD值帶入回歸方程，計算出的樣品濃度需再乘以稀釋倍數(shù)（本樣品稀釋10倍），即為實際樣品濃度。3.3.1 NO

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本文編號：2816237