背景糖尿病是一類嚴(yán)重威脅全球人類生命健康的代謝性疾病,高血糖為其主要特征。中晚期糖尿病患者往往伴隨有多器官受損的并發(fā)癥,如心臟、腎臟、腦和血管等,這是導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降甚至死亡的主要原因,其中對心臟的損害尤為嚴(yán)重。作為糖尿病心血管疾病常見的并發(fā)癥之一,糖尿病心肌病已成為心力衰竭和死亡的主要原因。先前研究顯示:血管內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞的功能障礙在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。除此之外,高血糖導(dǎo)致氧化應(yīng)激和其他細(xì)胞信號的異常變化、腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化及游離的脂肪酸增多等多種機制也參與糖尿病心肌損傷的發(fā)生發(fā)展。近年來,越來越多的國內(nèi)外研究揭示炎癥反應(yīng)在糖尿病誘發(fā)的心肌損傷中也發(fā)揮著重要作用,長期炎癥環(huán)境下可導(dǎo)致細(xì)胞及組織損傷,誘導(dǎo)其死亡。NLRP3炎癥小體作為炎癥活化的一種重要形式,在組織損傷中起著關(guān)鍵的作用,因此抑制NLRP3炎癥小體的活化可能是改善高糖誘導(dǎo)心肌損傷的有效策略之一。絞股藍(lán)總皂苷作為一種傳統(tǒng)中藥的主要組分,具有抗炎和改善心血管疾病的功效,但其作用機制并不明確。在本研究中,我們擬用絞股藍(lán)總皂苷,以探究其是否可通過抑制NLRP3炎癥小體的活化改善高糖誘導(dǎo)的心肌損傷。目的通過建立體內(nèi)外高糖誘導(dǎo)心肌損傷模型,研究NLRP3炎癥小體是否參與高糖誘導(dǎo)的心肌損傷及其作用機制,并探討絞股藍(lán)總皂苷在改善高糖誘導(dǎo)心肌損傷過程中的作用及機制。方法體外研究中:利用不同濃度葡萄糖分別處理大鼠心肌細(xì)胞系(H9C2)6 h、12 h、24 h、36 h和48 h,分為正常對照組(5.5 mM),中等糖濃度組(25 mM)及高糖組(35mM)。乳酸脫氫酶法分析心肌細(xì)胞損傷情況;四甲基偶氮唑鹽法分析細(xì)胞活力情況;利用原位末端標(biāo)記法及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況;通過實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測炎癥小體相關(guān)分子asc、caspase-1和il-1β的基因水平;利用蛋白印跡法及免疫熒光檢測炎癥小體相關(guān)分子的蛋白水平;應(yīng)用caspase-1抑制劑(z-yvad-fmk)后,乳酸脫氫酶法分析細(xì)胞損傷情況,同時蛋白印跡法檢測炎癥相關(guān)分子的蛋白水平;通過線粒體分離檢測細(xì)胞色素c的釋放,并應(yīng)用細(xì)胞色素c及ros抑制劑(cyclosporina及nac)后,乳酸脫氫酶法分析細(xì)胞損傷情況,蛋白印跡法檢測炎癥相關(guān)分子的蛋白水平;應(yīng)用絞股藍(lán)總皂苷后,通過流式細(xì)胞術(shù)、乳酸脫氫酶法及四甲基偶氮唑鹽法檢測細(xì)胞的凋亡、損傷及活力;同時蛋白印跡法檢測細(xì)胞色素c的釋放以及炎癥小體的活化情況;體內(nèi)建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,模型建立成功后,給予z-yvad-fmk(240ng/只/次,共6次,尾靜脈注射)及絞股藍(lán)總皂苷(400mg/kg/次,共14次,灌胃)治療;實驗結(jié)束后,處死大鼠,取心肌組織并提取總rna,實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測炎癥相關(guān)分子的基因水平;同時提取心臟組織總蛋白,通過蛋白印跡法檢測炎癥相關(guān)分子的蛋白水平;利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)檢測大鼠外周血中白細(xì)胞介素1β(il-1β)含量;獲取大鼠心肌組織并固定,制作石蠟切片進(jìn)行蘇木素伊紅染色,檢測心肌組織的的病理學(xué)變化,免疫組化檢測心肌組織中炎癥小體的表達(dá)及分布情況。結(jié)果成功建立高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型及Ⅱ型糖尿病大鼠模型。乳酸脫氫酶法及四甲基偶氮唑鹽法檢測結(jié)果顯示:與正常對照組(5.5mm)相比,短時間內(nèi)(6h和12h),中等糖濃度(25mm)及高糖(35mm)并不能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞受損,可隨著時間的推移,細(xì)胞損傷情況加重,活力逐漸降低,并有濃度和時間依賴性;原位末端標(biāo)記法及流式細(xì)胞術(shù)顯示高糖可顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡;實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)顯示高糖顯著上調(diào)炎癥小體相關(guān)因子的基因水平,同時蛋白印跡法及免疫熒光證明高糖上調(diào)炎癥小體相關(guān)因子的蛋白表達(dá)量;應(yīng)用z-yvad-fmk后,下調(diào)了炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)量,進(jìn)而改善細(xì)胞損傷;線粒體分離結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞漿中,在48h最明顯,cyclosporina可減少細(xì)胞色素c的釋放,抑制炎癥小體的活化以及改善細(xì)胞損傷;同時,ros抑制劑nac顯著降低線粒體中細(xì)胞色素c的釋放以及炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá),改善細(xì)胞損傷;應(yīng)用絞股藍(lán)總皂苷后,抑制了細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞漿中,同時nlrp3及相關(guān)蛋白表達(dá)均降低,進(jìn)而改善細(xì)胞損傷;在糖尿病大鼠心肌組織中,nlrp3、asc、caspase-1及il-1β的基因及蛋白水平顯著上升;給予z-yvad-fmk及絞股藍(lán)總皂苷治療后,相關(guān)基因及蛋白表達(dá)降低。elisa顯示糖尿病大鼠外周血血清中IL-1β的含量明顯高于正常大鼠,應(yīng)用Z-YVAD-FMK及絞股藍(lán)總皂苷后IL-1β后的含量顯著降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異。HE染色顯示與正常大鼠相比,糖尿病大鼠的心肌組織損傷嚴(yán)重,給予Z-YVAD-FMK及絞股藍(lán)總皂苷后,損傷程度明顯減輕;免疫組化結(jié)果顯示糖尿病大鼠的心肌組織中有明顯的炎癥蛋白陽性顆粒,而給予Z-YVAD-FMK及絞股藍(lán)總皂苷治療后炎癥蛋白明顯減少。結(jié)論上述體外及體內(nèi)實驗均證明,高糖激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)心肌損傷,其作用機制是高糖導(dǎo)致線粒體受損,釋放ROS,進(jìn)而促使細(xì)胞色素c釋放入胞質(zhì),激活NLRP3炎癥小體,活化的NLRP3炎癥小體促進(jìn)IL-1β的成熟釋放,進(jìn)而介導(dǎo)心肌損傷。同時,傳統(tǒng)中藥絞股藍(lán)總皂苷通過抑制細(xì)胞色素c的釋放,調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活化,改善高糖誘導(dǎo)的心肌損傷,為臨床運用提供了理論支持。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R587.2

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本文編號：2816211