背景46,XY性發(fā)育異常(disorders of sex development,DSD)患者主要以外生殖器男性化不足為特征,可有性腺發(fā)育異常,伴或不伴苗勒氏管結(jié)構(gòu)。其遺傳背景復(fù)雜,目前已發(fā)現(xiàn)30余個(gè)相關(guān)致病基因,由于不同基因突變患者臨床表型缺乏特異性,準(zhǔn)確的診斷依賴基因測(cè)序技術(shù)。傳統(tǒng)的一代測(cè)序通量低,測(cè)序成本高,對(duì)46,XYDSD患者突變基因檢出率不超過(guò)20%。因此,選用適當(dāng)?shù)幕驕y(cè)序方法來(lái)提高該類患者基因檢出率具有重要意義。NR51(nuclear receptor subfamily 5 group A member 1)基因突變是46,XYDSD較為常見的病因,其發(fā)生率約為10-20%。NR5A1是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控多種類固醇激素合成及性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺及性腺的發(fā)育有重要作用。研究NR5A1基因突變患者臨床特征及突變位點(diǎn)的致病性,有助于提高對(duì)該類疾病及NR5A1蛋白重要功能位點(diǎn)的認(rèn)識(shí)。目的本研究將對(duì)46,XY DSD患者進(jìn)行致病基因突變的篩查,以明確該類患者致病基因的分布及其發(fā)生率;分析NR5A1基因突變患者臨床表型,同時(shí)對(duì)NR5A1突變蛋白進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其致病性。方法2016年11月至2018年4月,在北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科性腺門診招募46,XY性發(fā)育異�；颊�,收集患者的一般臨床資料。采集外周血提取白細(xì)胞DNA。設(shè)計(jì)與性發(fā)育相關(guān)的基因外顯子區(qū)域的特異性的捕獲探針。采用目標(biāo)基因外顯子捕獲,聯(lián)合二代測(cè)序的方法,篩選患者的致病基因。進(jìn)一步用Sanger測(cè)序方法驗(yàn)證變異位點(diǎn)。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及微基因報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),分別驗(yàn)證突變型NR5A1對(duì)其靶基因CYP11A1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的影響及突變對(duì)NR5A1基因RNA剪接的影響。結(jié)果(1)本研究共納入46,XYDSD患者18例,其中10例患者檢測(cè)到46,XY DSD相關(guān)基因突變,基因突變檢出率為56%。AR基因和SRD5A2基因突變患者各3例,突變發(fā)生率為16.7%,NR5A1、LHCGR、CYP17A1、MAP3K1基因突變各檢出1例,發(fā)生率為5.6%。(2)在前期研究基礎(chǔ)上,納入12例檢測(cè)到NR5A1基因罕見變異的46,XYDSD患者,所有患者均表現(xiàn)為性發(fā)育異常,不存在腎上腺皮質(zhì)功能減退的癥狀。其中2例患者為男性社會(huì)性別,10例患者為女性社會(huì)性別。體格檢查顯示5例患者外生殖器表現(xiàn)為完全女性外陰,3例患者表現(xiàn)為陰蒂肥大,3例患者為外生殖器難辨,1例患者表現(xiàn)為尿道下裂。所有患者性腺為睪丸,45%的患者存在苗勒氏管結(jié)構(gòu)。激素檢查顯示,除3例患者處于青春發(fā)育前期及1例患者處于微小青春期外,其余患者均存在促性腺激素水平升高,2例患者血睪酮水平處于正常范圍。(3)41.7%(5/12例)的NR5A1基因突變?yōu)榧褐虏⊥蛔?包括p.Ser32Asn,p.Gly35Asp,p.Asn44del,p.Arg84Cys 及 p.Leu233_Glu234insLeuGlnLeu。58.3%(7/12例)的罕見變異未見數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道,包括p.Ser21Phe,p.Lys45Glu,p.Ala82Ser,p.Arg89Ser,p.Gly91Asp,p.Arg255Profs*44 和 p.Gln362Serfs*20。體外雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示4例罕見錯(cuò)義變異僅Gly91 Asp突變使NR5A1轉(zhuǎn)錄活性降低為野生型的39%;Ser21Phe突變體轉(zhuǎn)錄活性為野生型的76%,Ala82Ser和Arg89Ser突變體轉(zhuǎn)錄活性與野生型無(wú)差異。微基因報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示c.244GA(Ala82Ser)導(dǎo)致NR5A1基因2號(hào)外顯子剪接異常,出現(xiàn)3'末端19個(gè)堿基或整個(gè)2號(hào)外顯子缺失的剪接體。結(jié)論目的基因外顯子捕獲聯(lián)合二代測(cè)序是對(duì)46,XY DSD患者進(jìn)行基因突變篩查的有效方法,其突變檢出率約為56%。在本研究隊(duì)列中,AR和SRD5A2基因突變較為常見,約占46,XY DSD患者一半以上。NR5A1基因突變患者主要表現(xiàn)為性發(fā)育異常,未見腎上腺功能減退。分別有1個(gè)罕見變異影響NR5A1對(duì)CYP11A1的轉(zhuǎn)錄活性或NR5A1基因的RNA剪接,提示有必要通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證罕見變異對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響,從而準(zhǔn)確評(píng)估罕見變異的致病性。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R588
【部分圖文】：

內(nèi)含子和外顯子會(huì)一同被轉(zhuǎn)錄，形成前ｍＲＮＡ。前ｍＲＮＡ在翻譯為蛋白逡逑質(zhì)前，需經(jīng)過(guò)剪接加工，除去內(nèi)含子序列，并連接剩余的外顯子序列而形成成熟的逡逑ｍＲＮＡＷ３（）Ｕ?qǐng)D１－１）。這一剪接反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞核中，受多種順式作用元件和反式作逡逑用因子的相互作用調(diào)節(jié)［３１］。逡逑５＇邋ｓｓ邐３＊邋ｓｓ逡逑＿邐｜邐Ｉｎｔｒｏｎ邋Ｂｒａｎｃｈ邋＝邐（邐｜逡逑一…．…淦………－邐：邐羞一．．．．．一ｊ邐ＩＳＥ邐ＩＳＳ邋ｐｏｉｎｔ邐，二二二■．邋ｊ—逡逑ＥＳＥ邐ＥＳＳ邐＊邐ＥＳＥ邐ＥＳＳ逡逑？逡逑ｔ逡逑Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ病、逡逑ｉｉ｜（｜ｏｔｅｉｎ｜邐ｇｓ｜0ｉｅ？ｒ．＊逡逑Ｅｘｏｒｎ邋＾Ｅｘｏｎ２邐｜３．逡逑ＥＳＥ邐ＥＳＳ邋＾邐ＥＳＥ邐ＥＳＳ逡逑＃邋Ｉｎｔｒｏｎ邋ｊｒ邐ｍ逡逑５－邋．邋Ｉ邐Ｅｘｏｎｌ邋｜邐ｊ邋＾＿＿：邐—２邋｜邐｜邋３－逡逑＊邐ＥＳＥ邐ＥＳＳ邐ＥＳＥ邐ＥＳＳ逡逑圖１－］：真核生物基因剪接過(guò)程逡逑順式作用元件包括５＇剪接位點(diǎn)，３＇剪接位點(diǎn)，外顯子剪接增強(qiáng)子（ＥＳＥ）和外顯逡逑子剪接沉默子（ＥＳＳ），內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子（ＩＳＥ）和內(nèi)含子剪接沉默子（ＩＳＳ）。反逡逑式作用因子包含剪接體，不均一核糖核蛋白（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ邋Ｎｕｃｌｅａｒ逡逑Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｈｎＲＮＰ）和絲氨酸－精氨酸蛋白（ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＲ）等逡逑［３１］。剪接體由５個(gè)小的核糖核蛋白復(fù)合體（ｓｎＲＮＰｓ：邋Ｕｌ，Ｕ２，邋Ｕ４，Ｕ５和Ｕ６）以逡逑及１５０種以上蛋白質(zhì)組成

其中他基因變異患者３例（３／１８例，１６．６％），雙／乃７２基因變異患者３逡逑例（３／１８邋例，１６．６°／。），尤７邋基因突變各檢出邋１邋例逡逑（１／１８例，５．６％）（圖３－１）。詳細(xì)變異位點(diǎn)信息見表３－３。其中５０％邋（５／１０個(gè)）為錯(cuò)逡逑義突變，２０％邋（２／１０個(gè)）為剪接位點(diǎn)突變，缺失突變、無(wú)義突變及同義突變的發(fā)生逡逑率均為１０％邋（１／１０個(gè)）。５０％邋（５／１０個(gè)）的突變位點(diǎn)為已知致病突變，５０％邋（５／１０逡逑個(gè)）突變位點(diǎn)為臨床意義未明的罕見變異。逡逑＇ｆｔ邋＿逡逑圖３－丨：４６，ＸＹ邋ＤＳＤ患者二代測(cè)序結(jié)果逡逑表３－３：邋４６，ＸＹ邋ＤＳＤ患者二代測(cè)序檢出罕見基因變異位點(diǎn)結(jié)果逡逑編號(hào)邋基因邋Ｃ．ＤＮＡ改變邐氨基酸改變邐ＳＮＰ邋（ＭＡＦ）邐臨床意義逡逑ＤＳＤ－Ｙ０１邐ＡＲ邐ｃ．邋２６０８Ａ＞Ｔ邐ｐ．ｌｌｅ８７０Ｐｈｅ邐半合逡逑ＤＳＤ－Ｙ０７邐ＡＲ邐ｃ．２０７１＿２０７３ｄｅｌ邐ｐ．６９１ｄｅｌ邐半合邐已知致病突變［３９］逡逑ＤＳＤ－Ｙ０９邐ＡＲ邐ｃ．邋１８４７Ｇ＞Ａ邐ｐ．Ａｒｇ６１６Ｈ

基因突變位點(diǎn)氨基酸８７０Ｉｌｅ、基因突變位點(diǎn)氨基酸２１０Ｐｒｏ及逡逑Ｚ／ＺＣＧｉ？基因突變位點(diǎn)氨基酸３３０Ａｓｐ在人、小鼠、大鼠、獼猴、猩猩、豬、狗、牛、逡逑兔、貓、爪蛙、斑馬魚等不同物種中高度保守（圖３－３）。逡逑３７逡逑

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