【摘要】：背景及目的:糖尿病性膀胱病(Diabetic cystopathy,DCP)晚期主要表現為失代償性的膀胱興奮性下降和逼尿肌收縮無力,導致排尿困難、殘余尿增加、慢性尿潴留及充溢性尿失禁等臨床癥狀,現有理論認為發(fā)生機制可能包括:支配膀胱的相關神經損害,膀胱逼尿肌功能受損,膀胱泌尿上皮功能改變,膀胱間質內膠原纖維比例降低和彈力纖維合成增加和尿道協(xié)調失衡等。而現在越來越來的研究證實,晚期逼尿肌細胞的功能異常和數量減少是導致膀胱收縮無力進而出現一系列相應癥狀的最直接原因。本課題擬深入研究和闡明逼尿肌細胞在DCP晚期逼尿肌無力發(fā)生中的病理基礎和分子機制,并初步觀察尿源性干細胞的修復治療效果。方法:第一部分:研究ICC細胞興奮異常在DCP逼尿肌無力中的作用我們通過腹腔注射鏈脲佐菌素加高脂高糖飲食建立大鼠糖尿病模型,將大鼠分為兩組:1.正常大鼠:NC;2.DCP大鼠:DCP。通過胰島素抵抗實驗、膀胱測壓和纖維化分析鑒定模型建模成功;通過q RT-PCR、western blot和免疫熒光染色分析HCN通道核酸和蛋白表達分布差異;原代分離培養(yǎng)膀胱ICC細胞后,通過膜片鉗檢測HCN介導的Ih電流大小和通道活性差異;通過離體肌條張力測定和細胞內鈣離子濃度測定比較HCN通道對膀胱收縮力和鈣離子活動的作用差異;透射電鏡分析ICC細胞數量和其上小窩結構的表達差異,Western blot檢測小窩蛋白表達變化;免疫熒光染色和免疫共沉淀共定位小窩蛋白3和HCN通道蛋白,證明兩者間相互作用;使用si RNA轉染原代ICC細胞下調Caveolin-3表達水平,觀察比較Caveolin-3對HCN通道表達和通道功能活性的影響。第二部分:探討AGEs介導DCP逼尿肌細胞凋亡的作用機制收集DCP患者膀胱樣本,檢測AGEs和RAGE的表達差異。再通過第一部分建模方法建立DCP大鼠模型,SD大鼠分為四組:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠腹腔注射ALT-711治療:DCP+ALT-711;DCP大鼠口服AG治療:DCP+AG。通過檢測以下內容指標,觀察DCP大鼠的疾病狀態(tài)特點和ALT-711、AG的治療效果:免疫組化和Elisa實驗檢測血清、胰腺內胰島素含量和膀胱內AGEs的含量;繪制大鼠體重和空腹血糖變化曲線;膀胱測壓和離體肌條張力測定檢測膀胱排尿和收縮力變化;Western blot檢測RAGE、氧化應激和細胞凋亡關鍵調控蛋白SOD-2、Caspase-3的表達差異,觀察和細胞凋亡密切的MAPK信號通路相關蛋白表達差異;TUNEL染色和Masson染色檢測大鼠膀胱組織細胞凋亡和纖維化改變;原代分離培養(yǎng)膀胱逼尿肌細胞,通過外源性AGEs-BSA培養(yǎng)處理后,觀察其對細胞內活性氧ROS的濃度影響,探討時間和濃度依賴特性,檢測相關蛋白RAGE和SOD-2的表達變化;通過轉染si RNA-RAGE和si RNA-p38-MAPK后下調目的基因表達水平,檢測細胞內活性氧濃度變化和細胞凋亡百分比,證實該信號通路在AGEs誘導細胞氧化應激和細胞凋亡中的作用。第三部分:初步觀察尿源性干細胞對DCP逼尿肌無力大鼠模型的治療作用原代分離培養(yǎng)人尿源性干細胞,初步觀察其增值和轉分化特性。將分離培養(yǎng)的人尿源性干細胞轉染攜帶e GFP的慢病毒進行標記,通過尾靜脈注射進入DCP大鼠體內,觀察人尿源性干細胞在體內重要器官的歸巢情況和治療效果,實驗分組為:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠注射人尿源性干細胞治療:DCP+USCs。觀察了大鼠血糖、體重、膀胱濕重、血生化指標、大鼠糖代謝情況變化;膀胱測壓和離體肌條收縮實驗觀察膀胱排尿功能和收縮力恢復情況;HE染色、Masson染色和TUNEL染色觀察大鼠逼尿肌纖維化和細胞凋亡情況;Western blot蛋白定量:α-SMA,Caspase-3。結果:1.低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射聯合高脂高糖高蛋白飲食可較好的模擬2型糖尿病模型,注射12周后大鼠膀胱出現糖尿病性膀胱病逼尿肌無力的典型表現;DCP大鼠膀胱中HCN通道四個亞型的核酸和蛋白表達量降低,HCN介導的Ih電流密度下降;HCN通道蛋白位于小窩結構域內,小窩及其結構蛋白Caveolin-3在DCP時表達降低,該蛋白可與HCN通道的四個亞型發(fā)生相互作用并正向調控HCN通道介導的Ih電流。2.DCP患者膀胱組織中AGEs含量和RAGE表達均顯著增加;口服氨基胍和腹腔注射阿拉氯胺治療DCP大鼠后,兩者均可在體阻斷AGEs的產生,進而抑制細胞氧化應激和凋亡,改善DCP大鼠的排尿功能和肌條收縮力;AGEs可在體外呈時間和濃度依賴性地誘導逼尿肌細胞活性氧ROS和細胞凋亡,使用si RNA干擾RAGE和p38-MAPK的表達后,AGEs誘導的細胞內ROS增加和細胞凋亡比率明顯受到抑制,相應的標志蛋白Caspase-3、SOD-2的表達也有所降低。3.成功在人尿液中分離提取了原代尿源性干細胞,并能有效增殖傳代,使用PDGF5ng/ml+TGFβ2.5ng/ml、VEGF 30ng/ml分別培養(yǎng)尿源性干細胞14天后,部分干細胞分化成上皮細胞和平滑肌細胞。每隔一周進行尾靜脈注射使用攜帶e GFP基因的尿源性干細胞后,干細胞可在胰腺歸巢,但未能在膀胱中檢測到歸巢細胞。但注射干細胞后,DCP膀胱纖維化和逼尿肌細胞凋亡得到有效機制,DCP大鼠逼尿肌收縮力和排尿功能也有不同程度改善。結論:1.膀胱ICC細胞的數量減少和其HCN通道蛋白表達和功能活性降低可能是DCP逼尿肌無力發(fā)生的重要分子基礎,小窩結構域內的Caveolin-3可與HCN通道的四個亞型發(fā)生相互作用并調控HCN通道的活性。2.AGEs在膀胱內過量堆積可激活RAGE/p38-MAPK信號通路誘導逼尿肌細胞氧化應激和細胞凋亡。3.原代分離人尿源性干細胞注射可抑制DCP膀胱纖維化和逼尿肌細胞凋亡,改善DCP大鼠逼尿肌收縮力和排尿功能。簡而言之,DCP的機制復雜,難以闡明�？赡苌婕半x子通道、神經受體和多種細胞病理過程的變化。同源尿源性干細胞可能是一種新的治療資源。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2

【參考文獻】

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2 尹焯;楊金瑞;;膀胱間質細胞與膀胱病理生理[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2014年06期

本文編號：2813206