目的microRNA是一類進(jìn)化上保守的小分子非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。有研究報(bào)道m(xù)icroRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化方面發(fā)揮作用,但在脂質(zhì)合成和脂質(zhì)分解方面的作用及相關(guān)的分子機(jī)制卻還有待探索。本研究在體外水平探討了miR-196b-5p在成脂分化、脂質(zhì)合成和脂質(zhì)分解中的功能及其作用機(jī)制。方法1.在骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2及間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2中,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)miR-196b-5p在轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后的變化。在兩個(gè)細(xì)胞系中升高或降低miR-196b-5p水平,成脂誘導(dǎo)分化后用油紅O染色、甘油三酯(triglyceride,TG)測(cè)定、qRT-PCR及Western blotting等技術(shù)手段檢測(cè)miR-196b-5p在ST2和C3H10T1/2成脂分化和脂合成過(guò)程中的作用。2.利用Targetscan靶基因預(yù)測(cè)軟件及雙熒光素酶酶活檢測(cè)技術(shù)確定了miR-196b-5p的靶基因,并通過(guò)Western blotting技術(shù)探究miR-196b-5p與靶基因有關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)系;利用功能獲得性實(shí)驗(yàn)和功能缺失性實(shí)驗(yàn)探究miR-196b-5p靶基因在脂肪細(xì)胞分化和脂合成中的作用;利用Rescue進(jìn)一步確定miR-196b-5p與靶基因有關(guān)信號(hào)通路之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果1.向ST2和C3H10T1/2細(xì)胞系轉(zhuǎn)入體外miR-196b-5p模擬物mimics后,細(xì)胞內(nèi)miR-196b-5p水平顯著增加。利用miR-196b-5p mimics升高miR-196b-5p水平后,明顯促進(jìn)細(xì)胞成脂分化,TG水平上升,脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)、脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,aP2)和脂聯(lián)素(adiponectin,Adipoq)顯著增加,脂質(zhì)合成關(guān)鍵因子硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,Scd1)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fasn)、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白同種型c(sterol regulatory element-binding protein 1 isoform c,Srebp1c)和乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1,Acc1)、脂滴包被蛋白(perilipin)以及脂質(zhì)分解特征性因子過(guò)氧化物酶體�；o酶A氧化酶1(peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1,Acox1)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,Atgl)和脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase,Lpl)的表達(dá)量均上調(diào)。反之,利用miR-196b-5p inhibitor抑制miR-196b-5p后,則明顯抑制細(xì)胞成脂分化及上述基因的表達(dá)。2.利用Targetscan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了miR-196b-5p潛在靶基因?yàn)榻Y(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)的雷帕霉素不敏感的伴侶(rapamycin-insensitive companion of mammalian target of rapamycin,Rictor);成功構(gòu)建包含miR-196b-5p結(jié)合序列的Tsc1和Rictor 3’UTR的重組基因載體,并通過(guò)雙熒光素酶酶活檢測(cè)證明了miR-196b-5p能夠與Tsc1 3’UTR結(jié)合而降低熒光素酶表達(dá)活性,結(jié)合位點(diǎn)突變后熒光素酶酶活性增加;miR-196b-5p能夠抑制Tsc1蛋白表達(dá)水平,以上均證明Tsc1為miR-196b-5p靶基因。轉(zhuǎn)染miR-196b-5p的ST2細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后,哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,mTOR)、S6激酶β-1(S6 kinase beta-1,S6K1)、核糖體蛋白S6(Ribosomal protein S6,RPS6)和4E結(jié)合蛋白1(4E-binding protein 1,4EBP1)磷酸化蛋白水平升高,證明miR-196b-5p能夠激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)信號(hào)通路。構(gòu)建Tsc1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行功能獲得性實(shí)驗(yàn),合成siRNA進(jìn)行功能缺失性實(shí)驗(yàn);靶基因功能實(shí)驗(yàn)表明,過(guò)表達(dá)Tsc1能夠抑制ST2細(xì)胞成脂分化,脂質(zhì)合成及分解因子也顯著下調(diào),而抑制內(nèi)源性Tsc1表達(dá)則顯著促進(jìn)ST2細(xì)胞成脂分化,相關(guān)因子顯著上調(diào)。Rapamycin抑制mTORC1信號(hào)通路后,能夠拯救被miR-196b-5p促進(jìn)的成脂分化水平。結(jié)論1.miR-196b-5p mimics能顯著增加miR-196b-5p在ST2和C3H10T1/2細(xì)胞中的水平。miR-196b-5p mimics可以促進(jìn)細(xì)胞成脂分化、脂質(zhì)合成和脂質(zhì)分解;反之miR-196b-5p inhibitor則抑制細(xì)胞成脂分化、脂質(zhì)合成和脂質(zhì)分解。2.Tsc1是miR-196b-5p的靶基因。3.miR-196b-5p過(guò)表達(dá)可以激活mTORC1信號(hào)通路。4.Tsc1過(guò)表達(dá)能夠抑制ST2細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,脂質(zhì)合成和脂質(zhì)分解相關(guān)因子明顯下調(diào);Tsc1被抑制后細(xì)胞成脂分化被促進(jìn),脂質(zhì)合成和脂質(zhì)分解相關(guān)因子顯著上調(diào)。5.通過(guò)抑制劑Rapamycin,驗(yàn)證了miR-196b-5p通過(guò)mTORC1信號(hào)通路調(diào)控成脂分化。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 結(jié)果1 轉(zhuǎn)染后 ST2 和 C3H10T1/2 細(xì)胞系中 miR-196b-5p 水平的檢測(cè)為了檢測(cè) miR-196b-5p mimics 在 ST2 和 C3H10T1/2 細(xì)胞系中是否-196b-5p 水平，我們將 miR-196b-5p mimics 及其陰性對(duì)照 NC mimics ST2 和 C3H10T1/2 細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到 100%時(shí)測(cè)定 miR-196b-的水平變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 miR-196b-5p mimics 后，ST2 細(xì)-196b-5p 成熟體的水平為陰性對(duì)照組的 76 倍（圖 1.1 A）；C3H10T1/2miR-196b-5p 成熟體的水平為陰性對(duì)照組的 80.29 倍（圖 1.1 B），-196b-5p mimics 在 ST2 和 C3H10T1/2 細(xì)胞中能夠有效增加 miR-196b

圖 1.2 miR-196b-5p mimics 對(duì) ST2 成脂分化的影響（200×）* 與 Control 相比，P < 0.05成脂誘導(dǎo)3 d后qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)成脂相關(guān)特異性基因表達(dá)qRT-PCR 結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγC/EBP 、aP2、Adipsin 和 Adipoq mRNA 水平表達(dá)量均上調(diào)（圖 1.3 A），其表達(dá)量分別是陰性對(duì)照組的 2.80 倍、2.27 倍、4.01 倍、3.59 倍和 7.36 倍；Westerblotting 結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγ、C/EBP 、aP2 蛋白的表達(dá)量均上調(diào)（圖 1.3 B），其蛋白灰度分別是陰性對(duì)照組的 2.18 倍、11.05 倍和 2.27 倍（圖 1.3 C）。

圖 1.2 miR-196b-5p mimics 對(duì) ST2 成脂分化的影響（200×）* 與 Control 相比，P < 0.05成脂誘導(dǎo)3 d后qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)成脂相關(guān)特異性基因表達(dá)。qRT-PCR 結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγ、C/EBP 、aP2、Adipsin 和 Adipoq mRNA 水平表達(dá)量均上調(diào)（圖 1.3 A），其表達(dá)量分別是陰性對(duì)照組的 2.80 倍、2.27 倍、4.01 倍、3.59 倍和 7.36 倍；Westernblotting 結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγ、C/EBP 、aP2 蛋白的表達(dá)量均上調(diào)（圖 1.3 B），其蛋白灰度分別是陰性對(duì)照組的 2.18 倍、11.05 倍和 2.27 倍（圖 1.3 C）。

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本文編號(hào)：2812741