目的microRNA是一類進化上保守的小分子非編碼RNA,在轉錄后水平發(fā)揮調控作用。有研究報道m(xù)icroRNA在間充質干細胞成脂分化方面發(fā)揮作用,但在脂質合成和脂質分解方面的作用及相關的分子機制卻還有待探索。本研究在體外水平探討了miR-196b-5p在成脂分化、脂質合成和脂質分解中的功能及其作用機制。方法1.在骨髓基質細胞系ST2及間充質干細胞系C3H10T1/2中,運用實時定量PCR(qRT-PCR)技術檢測miR-196b-5p在轉染miR-196b-5p mimics后的變化。在兩個細胞系中升高或降低miR-196b-5p水平,成脂誘導分化后用油紅O染色、甘油三酯(triglyceride,TG)測定、qRT-PCR及Western blotting等技術手段檢測miR-196b-5p在ST2和C3H10T1/2成脂分化和脂合成過程中的作用。2.利用Targetscan靶基因預測軟件及雙熒光素酶酶活檢測技術確定了miR-196b-5p的靶基因,并通過Western blotting技術探究miR-196b-5p與靶基因有關信號通路的調控關系;利用功能獲得性實驗和功能缺失性實驗探究miR-196b-5p靶基因在脂肪細胞分化和脂合成中的作用;利用Rescue進一步確定miR-196b-5p與靶基因有關信號通路之間的調控關系。結果1.向ST2和C3H10T1/2細胞系轉入體外miR-196b-5p模擬物mimics后,細胞內miR-196b-5p水平顯著增加。利用miR-196b-5p mimics升高miR-196b-5p水平后,明顯促進細胞成脂分化,TG水平上升,脂肪細胞分化關鍵因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增強子結合蛋白α(CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)、脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,aP2)和脂聯素(adiponectin,Adipoq)顯著增加,脂質合成關鍵因子硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,Scd1)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fasn)、甾醇調節(jié)元件結合蛋白同種型c(sterol regulatory element-binding protein 1 isoform c,Srebp1c)和乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1,Acc1)、脂滴包被蛋白(perilipin)以及脂質分解特征性因子過氧化物酶體�；o酶A氧化酶1(peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1,Acox1)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,Atgl)和脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase,Lpl)的表達量均上調。反之,利用miR-196b-5p inhibitor抑制miR-196b-5p后,則明顯抑制細胞成脂分化及上述基因的表達。2.利用Targetscan生物信息學軟件預測了miR-196b-5p潛在靶基因為結節(jié)性硬化癥復合物1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)和哺乳動物雷帕霉素靶點的雷帕霉素不敏感的伴侶(rapamycin-insensitive companion of mammalian target of rapamycin,Rictor);成功構建包含miR-196b-5p結合序列的Tsc1和Rictor 3’UTR的重組基因載體,并通過雙熒光素酶酶活檢測證明了miR-196b-5p能夠與Tsc1 3’UTR結合而降低熒光素酶表達活性,結合位點突變后熒光素酶酶活性增加;miR-196b-5p能夠抑制Tsc1蛋白表達水平,以上均證明Tsc1為miR-196b-5p靶基因。轉染miR-196b-5p的ST2細胞經成脂誘導分化后,哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin,mTOR)、S6激酶β-1(S6 kinase beta-1,S6K1)、核糖體蛋白S6(Ribosomal protein S6,RPS6)和4E結合蛋白1(4E-binding protein 1,4EBP1)磷酸化蛋白水平升高,證明miR-196b-5p能夠激活哺乳動物雷帕霉素靶點復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)信號通路。構建Tsc1過表達質粒進行功能獲得性實驗,合成siRNA進行功能缺失性實驗;靶基因功能實驗表明,過表達Tsc1能夠抑制ST2細胞成脂分化,脂質合成及分解因子也顯著下調,而抑制內源性Tsc1表達則顯著促進ST2細胞成脂分化,相關因子顯著上調。Rapamycin抑制mTORC1信號通路后,能夠拯救被miR-196b-5p促進的成脂分化水平。結論1.miR-196b-5p mimics能顯著增加miR-196b-5p在ST2和C3H10T1/2細胞中的水平。miR-196b-5p mimics可以促進細胞成脂分化、脂質合成和脂質分解;反之miR-196b-5p inhibitor則抑制細胞成脂分化、脂質合成和脂質分解。2.Tsc1是miR-196b-5p的靶基因。3.miR-196b-5p過表達可以激活mTORC1信號通路。4.Tsc1過表達能夠抑制ST2細胞向脂肪細胞分化,脂質合成和脂質分解相關因子明顯下調;Tsc1被抑制后細胞成脂分化被促進,脂質合成和脂質分解相關因子顯著上調。5.通過抑制劑Rapamycin,驗證了miR-196b-5p通過mTORC1信號通路調控成脂分化。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 結果1 轉染后 ST2 和 C3H10T1/2 細胞系中 miR-196b-5p 水平的檢測為了檢測 miR-196b-5p mimics 在 ST2 和 C3H10T1/2 細胞系中是否-196b-5p 水平，我們將 miR-196b-5p mimics 及其陰性對照 NC mimics ST2 和 C3H10T1/2 細胞，待細胞匯合度達到 100%時測定 miR-196b-的水平變化。結果顯示，轉染 miR-196b-5p mimics 后，ST2 細-196b-5p 成熟體的水平為陰性對照組的 76 倍（圖 1.1 A）；C3H10T1/2miR-196b-5p 成熟體的水平為陰性對照組的 80.29 倍（圖 1.1 B），-196b-5p mimics 在 ST2 和 C3H10T1/2 細胞中能夠有效增加 miR-196b

圖 1.2 miR-196b-5p mimics 對 ST2 成脂分化的影響（200×）* 與 Control 相比，P < 0.05成脂誘導3 d后qRT-PCR和Western blotting檢測成脂相關特異性基因表達qRT-PCR 結果顯示與陰性對照組相比，轉染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγC/EBP 、aP2、Adipsin 和 Adipoq mRNA 水平表達量均上調（圖 1.3 A），其表達量分別是陰性對照組的 2.80 倍、2.27 倍、4.01 倍、3.59 倍和 7.36 倍；Westerblotting 結果顯示與陰性對照組相比，轉染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγ、C/EBP 、aP2 蛋白的表達量均上調（圖 1.3 B），其蛋白灰度分別是陰性對照組的 2.18 倍、11.05 倍和 2.27 倍（圖 1.3 C）。

圖 1.2 miR-196b-5p mimics 對 ST2 成脂分化的影響（200×）* 與 Control 相比，P < 0.05成脂誘導3 d后qRT-PCR和Western blotting檢測成脂相關特異性基因表達。qRT-PCR 結果顯示與陰性對照組相比，轉染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγ、C/EBP 、aP2、Adipsin 和 Adipoq mRNA 水平表達量均上調（圖 1.3 A），其表達量分別是陰性對照組的 2.80 倍、2.27 倍、4.01 倍、3.59 倍和 7.36 倍；Westernblotting 結果顯示與陰性對照組相比，轉染 miR-196b-5p mimics 組中 PPARγ、C/EBP 、aP2 蛋白的表達量均上調（圖 1.3 B），其蛋白灰度分別是陰性對照組的 2.18 倍、11.05 倍和 2.27 倍（圖 1.3 C）。

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本文編號：2812741