【摘要】：目的:自身免疫甲狀腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)除可致甲狀腺破壞外,還可引起其他重要組織器官受累,其中AIT相關(guān)腦損害正逐漸受到關(guān)注。該病常伴有抗甲狀腺過(guò)氧化物酶(Thyroid peroxidase antibody,TPOAb)抗體和抗甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody,Tg Ab)增高,但研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺自身抗體滴度高低與腦病嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)性,其可能僅是一個(gè)自身免疫標(biāo)志物而非直接致病因素。這一發(fā)現(xiàn)提示,甲狀腺自身免疫反應(yīng)本身可能產(chǎn)生了引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的因素,而存在于甲狀腺和腦組織的共同抗原所誘發(fā)的交叉自身免疫反應(yīng)累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是最可能的致病機(jī)制。近期文獻(xiàn)報(bào)道了蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3(Protein disulfide-isomerase A3,PDIA3)能防止腦脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中的β淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)沉淀導(dǎo)致的斑塊形成,其能夠作為一種重要的抗細(xì)胞毒性神經(jīng)保護(hù)蛋白。并且PDI在下丘腦-垂體-甲狀腺軸中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)抗PDIA3抗體(PDIA3Ab)在一些免疫性疾病中有升高,PDIA3Ab對(duì)PDIA3活性有較強(qiáng)的抑制作用,其造成的功能改變可引起甲狀腺及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常。除此之外,PDIA3Ab可能通過(guò)ADCC、CDC引起組織細(xì)胞損傷。目前尚未報(bào)道PDIA3是否作為AIT發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中共存于甲狀腺和腦組織的靶抗原以及抗PDIA3抗體能否介導(dǎo)甲狀腺和腦功能的自身免疫性損傷。本研究將對(duì)高碘誘導(dǎo)的NOD.H-2h4自發(fā)性自身免疫甲狀腺炎(spontaneous autoimmune thyroiditis,SAT)小鼠模型以及Tg誘導(dǎo)的CBA/J實(shí)驗(yàn)性自身免疫甲狀腺炎(experiment autoimmune thyroiditis,EAT)小鼠的PDIA3Ab表達(dá)水平進(jìn)行分析,并使用PDIA3重組蛋白誘導(dǎo)CBA/J免疫易感小鼠,對(duì)上述的問(wèn)題進(jìn)行逐一探討,為臨床防治AIT和AIT相關(guān)腦損害提供新思路和新方向。研究方法:選取6周齡NOD.H-2h4雌性小鼠隨機(jī)分入高碘組和control組。高組飼以含0.05%碘化鈉的無(wú)菌水構(gòu)建SAT動(dòng)物模型。對(duì)照組飼以無(wú)菌雙蒸水。于實(shí)驗(yàn)開始后第12周處死小鼠。檢測(cè)PDIA3Ab及Tg Ab水平。HE染色觀察甲狀腺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。8周齡CBA/J雌性小鼠隨機(jī)分入EAT組和control組,EAT組小鼠先后間隔2周給予小鼠源Tg(murine,m Tg)200μg/只加弗氏佐劑二次免疫,構(gòu)建EAT動(dòng)物模型。control組給予等量無(wú)菌蒸餾水加弗氏佐劑作為對(duì)照。末次免疫后4周處死小鼠。檢測(cè)血清PDIA3Ab及Tg Ab水平。觀察甲狀腺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。確定正常成年小鼠甲狀腺和腦組織中PDIA3蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞定位。5周齡CBA/J雌性小鼠隨機(jī)分入PDIA3組和control組,也如給予m Tg免疫建立EAT的方式,PDIA3組小鼠先后間隔2周給予重組蛋白75μg/只加弗氏佐劑二次免疫。control組給予等量無(wú)菌蒸餾水加弗氏佐劑。分別于末次免疫后4周、6周、10周、14周和18周進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。檢測(cè)血清PDIA3Ab和Tg Ab水平,評(píng)估甲狀腺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。有無(wú)Ig G、補(bǔ)體C3、膜攻擊復(fù)合體MAC的沉積以及Cleaved caspase3檢測(cè)細(xì)胞凋亡。血清檢測(cè)TT4和TSH評(píng)估小鼠的甲狀腺功能。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL17、以及TGF-βm RNA表達(dá)。觀察大腦皮層及海馬微血管超微結(jié)構(gòu)。Morris水迷宮和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。GFAP的表達(dá)情況以及蛋白質(zhì)組微陣列(Microarray)檢測(cè)腦組織細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。結(jié)果:1.SAT組和EAT組小鼠造模成功,SAT組和EAT組小鼠血清中PDIA3Ab總Ig G水平與control組相比顯著升高(P0.05),并且與Tg Ab呈正相關(guān)(P0.05)。EAT組小鼠血清中PDIA3Ab總Ig G及亞型Ig G1、Ig G2a水平較control組顯著升高(P0.05)。EAT組小鼠血清中存在PDIA3Ab,可特異性識(shí)別共存于甲狀腺和腦組織中的自身抗原PDIA3。2.正常小鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腦組織中神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有PDIA3表達(dá),小膠質(zhì)細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)PDIA3表達(dá)。3.PDIA3重組蛋白免疫后10周起,各時(shí)點(diǎn)PDIA3組小鼠血清PDIA3Ab總Ig G及亞型Ig G1、Ig G2a、Ig G2b的水平較control組相比顯著升高(P0.05),其高水平狀態(tài)可持續(xù)至末次免疫后18周,亞型升高水平在不同時(shí)點(diǎn)以Ig G2a為主。4.RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PDIA3末次免疫后10周IL-4、IL17A以及TGF-βm RNA的表達(dá)較control組顯著升高(P0.05),PDIA3末次免疫后14、18周IL17A m RNA的表達(dá)較control組顯著升高(P0.05)。5.免疫后各時(shí)點(diǎn)PDIA3組小鼠血清Tg Ab總Ig G的水平較control組均未出現(xiàn)明顯差異。PDIA3組與control組甲炎發(fā)病率及甲炎評(píng)分無(wú)顯著性差異。6.PDIA3組小鼠甲狀腺內(nèi)的濾泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的補(bǔ)體C3以及膜攻擊復(fù)合體MAC沉積,濾泡上皮細(xì)胞的C3以及MAC沉積于末次免疫后10周起明顯高于control組。7.PDIA3組小鼠存在C3沉積的甲狀腺組織內(nèi)可見(jiàn)局部濾泡上皮細(xì)胞有Ig G沉積,沉積處的Ig G可能是PDIA3Ab。8.PDIA3組小鼠甲狀腺內(nèi)Cleaved Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組相比顯著增多,且末次免疫后14周和18周,PDIA3組小鼠血清中TSH濃度較對(duì)照組相比顯著升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P0.05)。9.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)末次免疫后10周起,各時(shí)期的PDIA3組小鼠逐漸出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降。LTP結(jié)果顯示,末次免疫后14周,小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的下降。10.透射掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),末次免疫后10周PDIA3組小鼠皮質(zhì)及海馬中的微血管周圍已出現(xiàn)明顯的水腫。11.末次免疫后10周起PDIA3組小鼠微血管內(nèi)皮和血管周圍神經(jīng)元有C3和MAC的沉積,C3沉積部位同時(shí)存在Ig G沉積,沉積處的Ig G可能是PDIA3Ab。12.TUNEL試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)末次免疫后10周起PDIA3組小鼠腦組織與control組相比存在明顯的細(xì)胞凋亡。13.末次免疫后10周control組和PDIA3組腦組織的細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-13、IL-12p70、MIG、MIP-1α有升高趨勢(shì),未出現(xiàn)明顯差異。結(jié)論:1.在SAT和EAT小鼠血清中存在特異性識(shí)別PDIA3的自身抗體存在。其Ig G型自身抗體升高的亞型中存在具有較強(qiáng)介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(CDC)的亞型(Ig G2a)。2.PDIA3為存在于小鼠正常的甲狀腺中的自身抗原。針對(duì)PDIA3的自身免疫可通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用損傷小鼠濾泡上皮細(xì)胞,損傷甲狀腺功能,導(dǎo)致甲狀腺的儲(chǔ)備功能減退。3.PDIA3為存在于小鼠正常的腦組織中的自身抗原。針對(duì)PDIA3的自身免疫反應(yīng)可通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用損傷大腦皮質(zhì)和海馬的微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,造成血管周圍組織水腫。補(bǔ)體C3進(jìn)入腦組織后,也可作用于神經(jīng)細(xì)胞,造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡,最終出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能下降的腦功能改變。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R581.4
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文冰凍切片 HE 染色可見(jiàn)，SAT 組小鼠甲狀腺內(nèi)甲狀腺濾泡大小不一并伴有不同程度的擴(kuò)張和破壞，其間可見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 1.1A,B）。ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中 TgAb 總 IgG 的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn) SAT 組小鼠血清中 TgAb 總 IgG 的水平較 control 組顯著升高（圖 1.1 C）。上述結(jié)果表明已成功建立 SAT 動(dòng)物模型。ABC

圖 1.2 小鼠甲狀腺病理組織學(xué)檢查及血清 TgAb 水平檢測(cè)A.control 組小鼠甲狀腺組織 HE 染色所見(jiàn)（×200）。B.EAT 組小鼠甲狀腺組織 HE 染所見(jiàn)（×200）。C.EAT 組及 control 組鼠血清 TgAb 總 IgG 水平檢測(cè)，血清稀釋比為 1:100EAT 組（n=20）及 control 組（n=16）比較：***P＜0.001。3.2 小鼠血清 PDIA3 總 IgG 及亞型表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果3.2.1 SAT 組小鼠血清 PDIA3 總 IgG 檢測(cè)結(jié)果利用間接 ELISA 法分析比較 SAT 組及 control 組鼠血清中 PDIA3 總 IgG水平，結(jié)果顯示：SAT 組鼠血清中 PDIA3 總 IgG 水平顯著高于 control 組（圖A），并且與 TgAb 呈正相關(guān)（圖 1.3 B）。AB

圖 1.2 小鼠甲狀腺病理組織學(xué)檢查及血清 TgAb 水平檢測(cè)A.control 組小鼠甲狀腺組織 HE 染色所見(jiàn)（×200）。B.EAT 組小鼠甲狀腺組織 HE 染色所見(jiàn)（×200）。C.EAT 組及 control 組鼠血清 TgAb 總 IgG 水平檢測(cè)，血清稀釋比為 1:1000；EAT 組（n=20）及 control 組（n=16）比較：***P＜0.001。3.2 小鼠血清 PDIA3 總 IgG 及亞型表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果3.2.1 SAT 組小鼠血清 PDIA3 總 IgG 檢測(cè)結(jié)果利用間接 ELISA 法分析比較 SAT 組及 control 組鼠血清中 PDIA3 總 IgG 的水平，結(jié)果顯示：SAT 組鼠血清中 PDIA3 總 IgG 水平顯著高于 control 組（圖 1.3A），并且與 TgAb 呈正相關(guān)（圖 1.3 B）。AB

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本文編號(hào)：2804914