【摘要】：目的:隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活方式的改變及老齡化進(jìn)程的加速,我國(guó)糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者的發(fā)病率正呈上升的趨勢(shì),嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)是DM微血管并發(fā)癥之一,長(zhǎng)期慢性高血糖是其發(fā)病基礎(chǔ),代謝、內(nèi)分泌及血液因素促其發(fā)生、發(fā)展。DR的發(fā)病機(jī)制主要有多元醇通路、蛋白激酶C活化、糖基化終產(chǎn)物形成及其受體活化、氨基己糖途徑和氧化應(yīng)激水平升高等,其中氧化應(yīng)激水平升高是DR發(fā)病的早期事件及始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此,研究氧化應(yīng)激損傷在DR發(fā)病中的作用及分子機(jī)制對(duì)DR的早期防治具有重要意義。Micro RNAs(mi RNAs)是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA,通過抑制m RNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯調(diào)控蛋白的表達(dá)。眾多研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激病理狀態(tài)下mi RNAs表達(dá)譜改變并通過其作用靶點(diǎn)發(fā)揮重要的作用。但在氧化應(yīng)激致DR發(fā)病早期,mi RNAs表達(dá)的改變及其對(duì)靶分子的調(diào)控機(jī)制尚不明了。自由基生成與降解不平衡會(huì)導(dǎo)致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平升高,從而增高氧化應(yīng)激水平,H2O2是體內(nèi)ROS的一種,并且血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DR發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要特征。因此,我們的研究通過給予原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)H2O2刺激制備氧化應(yīng)激細(xì)胞模型模擬DR早期病變,通過基因芯片技術(shù)檢測(cè)mi RNAs表達(dá)譜的改變。挑選出差異性表達(dá)mi RNAs對(duì)其進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證,通過在線軟件預(yù)測(cè)其靶分子,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,從而篩選出可能與氧化應(yīng)激致DR發(fā)生有關(guān)的mi RNAs,不僅可以在基因水平上進(jìn)一步揭示在DR發(fā)病的機(jī)制,同時(shí)為DR的治療提供了全新的角度。方法:原代HUVECs分離培養(yǎng):采用膠原酶灌注消化法分離HUVECs,接種至包被有多聚賴氨酸的25cm2的培養(yǎng)瓶中,24h后更換培養(yǎng)液,以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換培養(yǎng)液。當(dāng)原代細(xì)胞融合90%以上后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化,傳代培養(yǎng)。第四代內(nèi)皮細(xì)胞用于測(cè)定細(xì)胞活力及凋亡、壞死,并且收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行基因芯片篩選及Real-time PCR驗(yàn)證。原代HUVECs的鑒定:應(yīng)用兔抗人Ⅷ因子單克隆抗體對(duì)第一代HUVECs進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,鑒定原代HUVECs。CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力:顯微鏡下觀察,將第四代HUVECs隨機(jī)分為5組,每組中分別加入0μM、100μM、200μM、400μM、500μM、600μM、800μM的H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)8、16、24小時(shí),用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力,觀察細(xì)胞損傷情況,選擇合適的H2O2刺激濃度及刺激時(shí)間。Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測(cè)HUVECs凋亡及壞死率:將長(zhǎng)至約70%的第四代HUVECs隨機(jī)分為2組,其中一組加入正常培養(yǎng)液,另一組加入含200μM H2O2的培養(yǎng)液,24 h后用Annexin V-FITC/PI熒光染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVECs凋亡率及壞死率。提取細(xì)胞總RNA送至杭州聯(lián)川生物科技有限公司進(jìn)行mi RNAs基因芯片檢測(cè):提取正常培養(yǎng)和200μM H2O2刺激24 h后的HUVECs總RNA送至杭州聯(lián)川生物科技有限公司檢測(cè)HUVECs mi RNAs的表達(dá)譜。mi RNAs生物信息學(xué)分析:根據(jù)mi RNAs芯片結(jié)果、文獻(xiàn)中氧化應(yīng)激狀態(tài)下mi RNAs表達(dá)的改變和在mi RNAs在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)量篩選出25個(gè)可能與我們的研究相關(guān)的mi RNAs,應(yīng)用DAVID軟件對(duì)mi RNAs的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。篩選與DR發(fā)病有關(guān)的mi RNAs采用Real-time PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)采用x±s表示。用SPSS 13.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 HUVECs鑒定:兔抗人Ⅷ因子單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色,陽性反應(yīng)物呈棕黃色,反應(yīng)物分布于內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。顯微鏡下觀察,第一代HUVECs胞體飽滿,呈梭形或多邊形,細(xì)胞表面光滑,邊界清楚。2細(xì)胞活力測(cè)定:不同濃度的H2O2刺激HUVECs不同時(shí)間后,細(xì)胞活力明顯降低(P0.01),并且表現(xiàn)出一定的劑量和時(shí)間依賴性。3 Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測(cè)HUVECs凋亡及壞死:與正常培養(yǎng)的HUVECs比較,200μM H2O2刺激24 h后細(xì)胞凋亡與壞死明顯增多(P0.05)。4 mi RNAs芯片結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,H2O2刺激組有40個(gè)差異表達(dá)的mi RNAs(P0.05),綜合考慮mi RNAs芯片結(jié)果、文獻(xiàn)中氧化應(yīng)激狀態(tài)下mi RNAs表達(dá)的改變、mi RNAs在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)量及生物信息學(xué)分析的結(jié)果,我們的實(shí)驗(yàn)選擇mi R-638、mi R-1246、mi R-1275、mi R-4267、mi R-4324、mi R-4734、mi R-15b-5p進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證。5生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:這些差異性表達(dá)的mi RNAs參與了細(xì)胞凋亡、蛋白的泛素化及磷酸化、2型糖尿病、鈣離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)、血管平滑肌的收縮、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素信號(hào)通路、癌癥抑制與生成等多個(gè)生物學(xué)過程,其中21個(gè)mi RNAs的33個(gè)靶基因(包括mi R-4267)參與了凋亡的信號(hào)通路過程。6差異性表達(dá)mi RNAs的驗(yàn)證:結(jié)果顯示,mi R-638、mi R-1246、mi R-4267在HUVECs H2O2刺激組表達(dá)明顯上調(diào)與芯片結(jié)果大致相同。7對(duì)mi R-4267進(jìn)行GO分析,結(jié)果顯示:mi R-4267的靶基因主要參與了細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程的調(diào)控。結(jié)論:1 H2O2刺激HUVECs導(dǎo)致細(xì)胞活力明顯下降,細(xì)胞凋亡及壞死增加,說明氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與DR有密切的關(guān)系。2基因芯片結(jié)果顯示H2O2可引起HUVECs mi RNA表達(dá)譜的明顯改變,提示氧化應(yīng)激、mi RNAs參與DR的發(fā)病。3生物信息學(xué)分析結(jié)果揭示了氧化應(yīng)激狀態(tài)下mi RNAs可能參與凋亡信號(hào)通路,可能是DR發(fā)病機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2;R774.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 焦劍;李穎;;C肽與糖尿病視網(wǎng)膜病變[J];國(guó)際眼科雜志;2008年07期

2 許迅;鄒海東;;糖尿病視網(wǎng)膜病變的社區(qū)篩查和防治[J];中國(guó)眼耳鼻喉科雜志;2008年05期

本文編號(hào)：2804951