【摘要】：目的:支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種由多種細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及多種細(xì)胞組分共同參與的,以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道反應(yīng)性增高及氣道重塑為主要特征的慢性呼吸道疾病。作為一種常見(jiàn)的慢性病,哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅人類健康,已成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。研究哮喘的發(fā)病機(jī)制,預(yù)防和控制哮喘變態(tài)反應(yīng)性炎癥的發(fā)生和發(fā)展,受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,大量的研究認(rèn)為Th1/Th2免疫失衡是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ),而在哮喘的發(fā)病和發(fā)作中細(xì)胞免疫和體液免疫均參與其中。呼吸道病毒感染可以影響Th1/Th2平衡,從而在哮喘形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,是誘發(fā)哮喘及導(dǎo)致哮喘加重的重要因素。其中,導(dǎo)致嬰幼兒下呼吸道感染的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起哮喘的重要原因之一。有研究表明由于RSV感染引發(fā)支氣管炎的兒童,其以后發(fā)生反復(fù)喘息和哮喘的風(fēng)險(xiǎn)較其他兒童更高,其原因與RSV感染誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子分泌有關(guān)。然而也有相反報(bào)道證實(shí)初次RSV感染可在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ產(chǎn)生,從而下調(diào)Th2型免疫應(yīng)答,抑制病毒復(fù)制,減輕氣道炎癥反應(yīng)。近來(lái)還有研究發(fā)現(xiàn)RSV可以通過(guò)誘導(dǎo)角化細(xì)胞源性細(xì)胞因子的生成,下調(diào)OVA致敏哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。我們以往的研究亦顯示致敏前RSV感染可以減少肺組織中γδT細(xì)胞的數(shù)量,下調(diào)γδT細(xì)胞內(nèi)Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10mRNA表達(dá)并增加Th1型細(xì)胞因子IFN-γmRNA表達(dá)。RSV感染對(duì)哮喘的影響究竟如何,目前尚未十分明確。2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells,ILC2)是近年發(fā)現(xiàn)的一種固有免疫細(xì)胞,屬于固有淋巴細(xì)胞家族,是一類具有淋巴細(xì)胞典型形態(tài),但是缺乏特異性的抗原識(shí)別受體的淋巴細(xì)胞。ILC2來(lái)源于骨髓中的淋巴樣祖細(xì)胞,以往也曾被稱為自然輔助細(xì)胞(Natural helper cells,NHCs),nuocytes以及固有2型輔助細(xì)胞(innate type 2 helper cells,Ih2s)。ILC2主要產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-5(IL-5),IL-9以及IL-13等,其在變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答、寄生蟲感染及哮喘中的作用正日益引起人們的關(guān)注。ILC2作為機(jī)體中Th2型細(xì)胞因子的重要來(lái)源,在過(guò)敏性支氣管哮喘等變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),流感病毒H3N1感染能導(dǎo)致哮喘的特征性體征氣道高反應(yīng)性,而氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生并不依賴于適應(yīng)性免疫應(yīng)答,卻依賴于ILC2產(chǎn)生的IL-13,從而證實(shí)了固有免疫應(yīng)答在病毒誘發(fā)的哮喘中的作用,揭示了病毒感染誘導(dǎo)哮喘的新機(jī)制,即固有免疫細(xì)胞來(lái)源的IL-13的核心作用。新近的研究也證實(shí)OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型肺組織中的ILC2是OVA誘導(dǎo)的急性哮喘中IL-5和IL-13的重要來(lái)源。如前所述,ILC2在OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型中發(fā)揮著重要作用,RSV感染影響哮喘發(fā)生發(fā)展是否有固有免疫細(xì)胞ILC2的參與,其作用及機(jī)制如何,目前尚不清楚。故本研究利用感染RSV的OVA哮喘模型鼠,通過(guò)檢測(cè)小鼠肺組織中ILC2的生物活性改變,探討ILC2在RSV感染影響哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制,為哮喘的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)佐證。研究方法:1、病毒的繁殖與滴定Hep-2細(xì)胞增殖人類呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2),30%蔗糖超速離心法分離純化病毒粒子,-80℃冰箱保存?zhèn)溆�。病毒滴度采用組織細(xì)胞半數(shù)感染量(50%Tissue culture infection dose,TCID50)表示。2、動(dòng)物模型的建立和分組6-8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠,隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(MOCK組)、RSV感染組(RSV組)、OVA哮喘組(OVA組)及RSV感染哮喘組(RSV/OVA組)。OVA組于第0天和第12天腹腔注射OVA 20μg致敏(含20μg OVA和氫氧化鋁2.25mg,溶于100μL PBS),第19-24天將小鼠置于透明密閉容器中以1%OVA溶液霧化吸入激發(fā),每次20 min,1次/天。MOCK組采用相同劑量的PBS致敏和激發(fā)。在RSV/OVA組中,OVA初次致敏前一周鼻腔滴入20μL含1.0×10~6 TCID50RSV的懸液感染小鼠。末次霧化吸入后48小時(shí),收集標(biāo)本。RSV組經(jīng)含1.0×10~6TCID50RSV懸液滴鼻感染后7天收集標(biāo)本。3、RSV感染對(duì)OVA哮喘鼠氣道炎癥的影響(1)肺組織病理標(biāo)本制作及染色:取模型鼠左肺下葉,制備石蠟切片,HE染色,觀察肺組織炎癥浸潤(rùn)及其它病理學(xué)變化。PAS染色觀察肺組織杯狀細(xì)胞增生和粘液分泌情況。(2)瑞氏吉姆薩染色檢測(cè)BALF炎性細(xì)胞類型及數(shù)量用1mlPBS沖洗模型鼠肺泡,收集肺泡灌洗液,離心后重懸細(xì)胞沉淀,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)并制作涂片,瑞氏吉姆薩染色后顯微鏡下隨機(jī)選擇視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)分別計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量及其百分比。(3)ELISA法檢測(cè)BALF中Th1/Th2型細(xì)胞因子水平應(yīng)用ELISA檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)模型鼠肺泡灌洗液中Th2型細(xì)胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)及Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)的含量。(4)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)模型鼠肺組織中Th1/Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平提取模型鼠肺組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織局部Th2型細(xì)胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)及Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)的mRNA表達(dá)水平。4、RSV感染對(duì)OVA哮喘鼠ILC2數(shù)量及生物學(xué)活性的影響(1)肺組織單細(xì)胞懸液制備水合氯醛腹腔注射深度麻醉小鼠后提取模型鼠肺組織,剪碎,在含有200μg/ml膠原酶D和40μg/mlDNaseⅠ的培養(yǎng)液中震蕩消化,300目鋼網(wǎng)過(guò)濾收集肺組織單細(xì)胞懸液,紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,計(jì)數(shù)后懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中ILC2數(shù)量定量細(xì)胞濃度,將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×10~6。使用純化的FcII/III受體的抗體(CD16/32)阻斷Fc受體,消除非特異性的結(jié)合染色。將細(xì)胞重懸于100μL PBS溶液中,實(shí)驗(yàn)組加入熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞表面特異性抗原的抗體FITC-lineage cocktail、APC-anti-Mouse CD45及Percp-anti-Mouse ST2,對(duì)照組加入同樣熒光標(biāo)記的非特異性同型抗體,4℃避光反應(yīng)15min,以含2%胎牛血清的冰PBS液洗滌2次,細(xì)胞最后用300μL含2%胎牛血清的PBS重懸,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)ILC2細(xì)胞內(nèi)IL-5、IL-13及IL-4等細(xì)胞分子表達(dá)情況取上述實(shí)驗(yàn)制備的細(xì)胞懸液,將其與刺激劑50ng/ml的PMA,500ng/ml ionomycin,和10μg/ml brefeldin A充分混勻,放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5h。1ml2%FBS-PBS清洗兩遍,離心棄上清,加入熒光抗體FITC-lineage cocktail,APC-anti-Mouse CD45及Percp-anti-Mouse ST2,標(biāo)記ILC2細(xì)胞。加透膜液,重懸細(xì)胞,4℃孵育1h,加透膜洗液,清洗一次。4℃條件下1500rpm離心6min,棄上清。1ml PBS重懸,加入PE-anti-Mouse IL-5,PE-anti-Mouse IL-13,PE-anti-Mouse IL-4熒光抗體及isotype controls,避光冰浴30min,2%FBS-PBS 300μl重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。(4)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ILC2細(xì)胞IL-5,IL-13及IL-4 mRNA表達(dá)流式分選模型鼠肺組織ILC2細(xì)胞,利用Triozl試劑,提取總RNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)ILC2細(xì)胞中IL-5、IL-13及IL-4 mRNA表達(dá)。5、過(guò)繼性回輸ILC2對(duì)RSV/OVA模型鼠肺部炎癥的影響首次霧化前1h尾靜脈回輸2×10~4個(gè)/只ILC2細(xì)胞,于末次霧化后48h測(cè)定過(guò)繼性回輸ILC2后模型鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺部炎癥病理改變等相關(guān)指標(biāo)。6、致敏前RSV感染對(duì)OVA哮喘鼠IL-33/ST2信號(hào)通路的影響采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織局部細(xì)胞因子IL-33及ST2L mRNA表達(dá)水平。7、IL-33/ST2信號(hào)通路對(duì)肺組織ILC2數(shù)量及活性的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-33誘導(dǎo)后小鼠肺組織ILC2總數(shù)及分泌Th2型細(xì)胞因子的ILC2細(xì)胞數(shù)量。熒光定量PCR檢測(cè)封閉抗體阻斷ST2后ILC2細(xì)胞內(nèi)IL-4,IL-5及IL-13 mRNA表達(dá)情況。8、IL-33對(duì)ILC2細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路蛋白mRNA表達(dá)的影響為探討IL-33在小鼠肺組織ILC2細(xì)胞增殖和活化過(guò)程中是否依賴MAPKs及NF-κB信號(hào)途徑,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)經(jīng)IL-33誘導(dǎo)后小鼠肺組織ILC2細(xì)胞內(nèi)ERK-1、ERK-2、IRAK-1、IRAK-4、TRAF-6、JNK-1、JNK-2、NF-kB、P38及MyD88 mRNA表達(dá)情況。9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)采用SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為±S,采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),根據(jù)Levene法方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果使用Bonferroni或Games-Howell法進(jìn)行組間比較,P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、RSV感染減輕哮喘鼠氣道炎癥反應(yīng),降低哮喘鼠肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)OVA致敏和激發(fā)的BALB/c鼠氣道上皮增厚、管腔狹窄、肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加。致敏前感染RSV可以抑制OVA誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng),減輕模型鼠肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。2、RSV感染影響哮喘鼠肺泡灌洗液中Thl/Th2型細(xì)胞因子含量致敏前RSV感染明顯下調(diào)哮喘鼠肺泡灌洗液中IL-5及IL-13的含量,但增加了肺泡灌洗液中IFN-γ的含量。3、RSV感染影響哮喘鼠肺組織Thl/Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)致敏前RSV感染明顯抑制哮喘鼠肺組織細(xì)胞IL-4,IL-5及IL-13 mRNA的表達(dá),但增強(qiáng)肺局部IFN-γmRNA表達(dá)水平。4、RSV感染降低哮喘鼠肺組織內(nèi)ILC2細(xì)胞總數(shù)及分泌Th2型細(xì)胞因子的ILC2細(xì)胞數(shù)量致敏前感染RSV顯著降低哮喘鼠肺組織內(nèi)ILC2細(xì)胞總數(shù),分泌IL-4,IL-5和IL-13的活化ILC2細(xì)胞數(shù)亦因RSV感染而明顯下降。5、致敏前RSV感染影響哮喘鼠肺組織ILC2細(xì)胞中Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá).致敏前RSV感染明顯抑制哮喘鼠肺組織ILC2細(xì)胞IL-4、IL-5及IL-13 mRNA的表達(dá)6、ILC2細(xì)胞參與RSV感染對(duì)哮喘鼠氣道變態(tài)炎癥的影響作用RSV/OVA小鼠回輸了ILC2細(xì)胞后,肺炎性細(xì)胞數(shù)量明顯上升,其中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分比增加明顯。肺泡灌洗液中Th2型細(xì)胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)含量升高,肺組織中Th2型細(xì)胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)mRNA表達(dá)增強(qiáng),而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ在肺泡灌洗液中的含量下降,肺組織中mRNA表達(dá)減弱,證實(shí)ILC2細(xì)胞參與RSV感染對(duì)哮喘鼠氣道變態(tài)炎癥的影響作用。7、RSV感染降低哮喘鼠肺組織IL-33/ST2L mRNA的表達(dá)在本研究中我們利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)分析了小鼠肺組織IL-33和ST2LmRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與OVA組相比,RSV/OVA組小鼠肺組織IL-33和ST2LmRNA表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8、IL-33/ST2信號(hào)通路誘導(dǎo)BALB/c鼠肺組織ILC2的活化為進(jìn)一步證實(shí)IL-33/ST2信號(hào)通路在小鼠肺組織ILC2細(xì)胞增殖和活化中的作用,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-33誘導(dǎo)后小鼠肺組織ILC2數(shù)量及分泌Th2型細(xì)胞因子的情況,結(jié)果顯示IL-33顯著增加了肺組織中ILC2數(shù)量,并上調(diào)了分泌IL-5及IL-13的ILC2數(shù)量,對(duì)ILC2細(xì)胞具有一定的激活作用。而阻斷ST2受體可以抑制ILC2細(xì)胞內(nèi)IL-4、IL-5及IL-13的mRNA表達(dá)。9、IL-33活化ILC2細(xì)胞依賴MAPKs信號(hào)通路IL-33可以增加ILC2細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)途徑MyD88、IRAK-4及P38信號(hào)因子mRNA表達(dá)。結(jié)論:1、致敏前RSV感染可以降低過(guò)敏原誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)。2、致敏前RSV感染通過(guò)下調(diào)IL-33/ST2信號(hào)通路改變ILC2細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞因子分泌活性,左右氣道變態(tài)炎癥反應(yīng)過(guò)程。3、IL-33對(duì)ILC2細(xì)胞活化作用依賴于MAPKs信號(hào)途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R562.25
【圖文】：

1 致敏前 RSV 感染減少哮喘鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)如圖所示，MOCK 組小鼠肺組織細(xì)支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)支氣管整齊，管腔圓整。周圍血管和支氣管偶見(jiàn)極少量炎性細(xì)胞，但未見(jiàn)嗜酸性無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，氣管平滑肌及基底層無(wú)增厚，基底膜較薄，周圍組織無(wú)水RSV 組小鼠肺泡充血、增厚、斷裂；細(xì)支氣管及伴行血管周圍有少量炎性，主要是淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞；肺炎癥反應(yīng)較 OVA 哮喘組輕。OVA 組小鼠支氣管管壁增厚、管腔狹窄，細(xì)支氣管及伴行血管周圍可見(jiàn)以細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管粘膜皺壁減少，管腔內(nèi)栓，杯狀細(xì)胞增生，肺泡間隔不同程度增寬，部分?jǐn)嗔眩纬煞螝饽[。RSV/OVA 組小鼠氣道上皮增厚，管腔明顯狹窄，細(xì)支氣管壁及其周圍大量胞浸潤(rùn)，肺炎癥反應(yīng)較 RSV 組更重，但較 OVA 組有所減輕。MOCKRSV

大量杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌，AB-PAS 染色胞漿呈紫紅色，而經(jīng) RSV 感染后，杯狀細(xì)胞增生減輕、黏蛋白分泌減少。圖3.2 致敏前RSV感染減輕OVA哮喘鼠氣道杯狀細(xì)胞黏液蛋白的分泌（×200）圖中MOCK代表正常對(duì)照組，RSV代表單純RSV感染組，OVA代表OVA哮喘組，RSV/OVA代表 OVA 致敏前感染 RSV 的 RSV 感染哮喘組，采用 PAS 染色觀察肺組織杯狀細(xì)胞增生和黏液蛋白分泌。3.3 致敏前 RSV 感染降低哮喘鼠肺組織炎癥細(xì)胞數(shù)量小鼠肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果如下（圖 3.3）：細(xì)胞總數(shù)：與 MOCK 組相比，RSV 組、OVA 組及 RSV/OVA 組小鼠 BALF 中細(xì)胞總數(shù)均有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中RSV組、RSV/OVA組細(xì)胞總數(shù)升高幅度小于 OVA 組，與 OVA 組比較

IFN-γ：與 MOCK 組相比，RSV 組及 RSV/OVA 組 IFN-γ 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。OVA 組 IFN-γ 水平與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與RSV 組及RSV/OVA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05（）圖3.4D）。3.5 致敏前 RSV 感染影響哮喘鼠肺組織 Th1/Th2 型細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光 PCR 檢測(cè)肺組織 Th1/Th2 型細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 以及 IFN-γmRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示：相較于 MOCK 組，OVA 組及 RSV/OVA 組肺組織 IL-4，IL-5 及 IL-13 mRNA表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），證實(shí) OVA 哮喘是以 Th2 型免疫反應(yīng)為主的氣道炎癥疾病。其中 OVA 組肺組織 IL-4，IL-5 及 IL-13 mRNA 表達(dá)水平均高于 RSV/OVA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RSV 感染可以使小鼠肺組織 Th1 型細(xì)胞因子 IFN-γ 表達(dá)增強(qiáng)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2804067