【摘要】：目的:支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種由多種細胞包括嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞以及多種細胞組分共同參與的,以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道反應(yīng)性增高及氣道重塑為主要特征的慢性呼吸道疾病。作為一種常見的慢性病,哮喘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,嚴重威脅人類健康,已成為嚴重的全球公共衛(wèi)生問題。研究哮喘的發(fā)病機制,預(yù)防和控制哮喘變態(tài)反應(yīng)性炎癥的發(fā)生和發(fā)展,受到越來越多研究者的關(guān)注。哮喘的發(fā)病機制尚未完全明確,大量的研究認為Th1/Th2免疫失衡是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ),而在哮喘的發(fā)病和發(fā)作中細胞免疫和體液免疫均參與其中。呼吸道病毒感染可以影響Th1/Th2平衡,從而在哮喘形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,是誘發(fā)哮喘及導(dǎo)致哮喘加重的重要因素。其中,導(dǎo)致嬰幼兒下呼吸道感染的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起哮喘的重要原因之一。有研究表明由于RSV感染引發(fā)支氣管炎的兒童,其以后發(fā)生反復(fù)喘息和哮喘的風(fēng)險較其他兒童更高,其原因與RSV感染誘導(dǎo)Th2型細胞因子分泌有關(guān)。然而也有相反報道證實初次RSV感染可在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)較強的Th1型細胞因子IFN-γ產(chǎn)生,從而下調(diào)Th2型免疫應(yīng)答,抑制病毒復(fù)制,減輕氣道炎癥反應(yīng)。近來還有研究發(fā)現(xiàn)RSV可以通過誘導(dǎo)角化細胞源性細胞因子的生成,下調(diào)OVA致敏哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。我們以往的研究亦顯示致敏前RSV感染可以減少肺組織中γδT細胞的數(shù)量,下調(diào)γδT細胞內(nèi)Th2型細胞因子IL-4和IL-10mRNA表達并增加Th1型細胞因子IFN-γmRNA表達。RSV感染對哮喘的影響究竟如何,目前尚未十分明確。2型固有淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cells,ILC2)是近年發(fā)現(xiàn)的一種固有免疫細胞,屬于固有淋巴細胞家族,是一類具有淋巴細胞典型形態(tài),但是缺乏特異性的抗原識別受體的淋巴細胞。ILC2來源于骨髓中的淋巴樣祖細胞,以往也曾被稱為自然輔助細胞(Natural helper cells,NHCs),nuocytes以及固有2型輔助細胞(innate type 2 helper cells,Ih2s)。ILC2主要產(chǎn)生Th2型細胞因子如白細胞介素-5(IL-5),IL-9以及IL-13等,其在變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答、寄生蟲感染及哮喘中的作用正日益引起人們的關(guān)注。ILC2作為機體中Th2型細胞因子的重要來源,在過敏性支氣管哮喘等變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),流感病毒H3N1感染能導(dǎo)致哮喘的特征性體征氣道高反應(yīng)性,而氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生并不依賴于適應(yīng)性免疫應(yīng)答,卻依賴于ILC2產(chǎn)生的IL-13,從而證實了固有免疫應(yīng)答在病毒誘發(fā)的哮喘中的作用,揭示了病毒感染誘導(dǎo)哮喘的新機制,即固有免疫細胞來源的IL-13的核心作用。新近的研究也證實OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型肺組織中的ILC2是OVA誘導(dǎo)的急性哮喘中IL-5和IL-13的重要來源。如前所述,ILC2在OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型中發(fā)揮著重要作用,RSV感染影響哮喘發(fā)生發(fā)展是否有固有免疫細胞ILC2的參與,其作用及機制如何,目前尚不清楚。故本研究利用感染RSV的OVA哮喘模型鼠,通過檢測小鼠肺組織中ILC2的生物活性改變,探討ILC2在RSV感染影響哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制,為哮喘的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和實驗佐證。研究方法:1、病毒的繁殖與滴定Hep-2細胞增殖人類呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2),30%蔗糖超速離心法分離純化病毒粒子,-80℃冰箱保存?zhèn)溆�。病毒滴度采用組織細胞半數(shù)感染量(50%Tissue culture infection dose,TCID50)表示。2、動物模型的建立和分組6-8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠,隨機分為4組:正常對照組(MOCK組)、RSV感染組(RSV組)、OVA哮喘組(OVA組)及RSV感染哮喘組(RSV/OVA組)。OVA組于第0天和第12天腹腔注射OVA 20μg致敏(含20μg OVA和氫氧化鋁2.25mg,溶于100μL PBS),第19-24天將小鼠置于透明密閉容器中以1%OVA溶液霧化吸入激發(fā),每次20 min,1次/天。MOCK組采用相同劑量的PBS致敏和激發(fā)。在RSV/OVA組中,OVA初次致敏前一周鼻腔滴入20μL含1.0×10~6 TCID50RSV的懸液感染小鼠。末次霧化吸入后48小時,收集標本。RSV組經(jīng)含1.0×10~6TCID50RSV懸液滴鼻感染后7天收集標本。3、RSV感染對OVA哮喘鼠氣道炎癥的影響(1)肺組織病理標本制作及染色:取模型鼠左肺下葉,制備石蠟切片,HE染色,觀察肺組織炎癥浸潤及其它病理學(xué)變化。PAS染色觀察肺組織杯狀細胞增生和粘液分泌情況。(2)瑞氏吉姆薩染色檢測BALF炎性細胞類型及數(shù)量用1mlPBS沖洗模型鼠肺泡,收集肺泡灌洗液,離心后重懸細胞沉淀,計數(shù)細胞總數(shù)并制作涂片,瑞氏吉姆薩染色后顯微鏡下隨機選擇視野,計數(shù)200個細胞,依據(jù)細胞形態(tài)學(xué)特點分別計數(shù)中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量及其百分比。(3)ELISA法檢測BALF中Th1/Th2型細胞因子水平應(yīng)用ELISA檢測試劑盒,檢測模型鼠肺泡灌洗液中Th2型細胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)及Th1型細胞因子(IFN-γ)的含量。(4)實時定量PCR法檢測模型鼠肺組織中Th1/Th2型細胞因子mRNA表達水平提取模型鼠肺組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用實時定量熒光PCR技術(shù)檢測肺組織局部Th2型細胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)及Th1型細胞因子(IFN-γ)的mRNA表達水平。4、RSV感染對OVA哮喘鼠ILC2數(shù)量及生物學(xué)活性的影響(1)肺組織單細胞懸液制備水合氯醛腹腔注射深度麻醉小鼠后提取模型鼠肺組織,剪碎,在含有200μg/ml膠原酶D和40μg/mlDNaseⅠ的培養(yǎng)液中震蕩消化,300目鋼網(wǎng)過濾收集肺組織單細胞懸液,紅細胞裂解液裂解紅細胞,計數(shù)后懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中。(2)流式細胞術(shù)檢測肺組織中ILC2數(shù)量定量細胞濃度,將細胞數(shù)量調(diào)整為1×10~6。使用純化的FcII/III受體的抗體(CD16/32)阻斷Fc受體,消除非特異性的結(jié)合染色。將細胞重懸于100μL PBS溶液中,實驗組加入熒光標記的抗細胞表面特異性抗原的抗體FITC-lineage cocktail、APC-anti-Mouse CD45及Percp-anti-Mouse ST2,對照組加入同樣熒光標記的非特異性同型抗體,4℃避光反應(yīng)15min,以含2%胎牛血清的冰PBS液洗滌2次,細胞最后用300μL含2%胎牛血清的PBS重懸,用流式細胞儀進行檢測。(3)流式細胞儀檢測ILC2細胞內(nèi)IL-5、IL-13及IL-4等細胞分子表達情況取上述實驗制備的細胞懸液,將其與刺激劑50ng/ml的PMA,500ng/ml ionomycin,和10μg/ml brefeldin A充分混勻,放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5h。1ml2%FBS-PBS清洗兩遍,離心棄上清,加入熒光抗體FITC-lineage cocktail,APC-anti-Mouse CD45及Percp-anti-Mouse ST2,標記ILC2細胞。加透膜液,重懸細胞,4℃孵育1h,加透膜洗液,清洗一次。4℃條件下1500rpm離心6min,棄上清。1ml PBS重懸,加入PE-anti-Mouse IL-5,PE-anti-Mouse IL-13,PE-anti-Mouse IL-4熒光抗體及isotype controls,避光冰浴30min,2%FBS-PBS 300μl重懸細胞,上流式細胞儀進行檢測。(4)實時定量RT-PCR檢測ILC2細胞IL-5,IL-13及IL-4 mRNA表達流式分選模型鼠肺組織ILC2細胞,利用Triozl試劑,提取總RNA。采用實時定量PCR方法檢測ILC2細胞中IL-5、IL-13及IL-4 mRNA表達。5、過繼性回輸ILC2對RSV/OVA模型鼠肺部炎癥的影響首次霧化前1h尾靜脈回輸2×10~4個/只ILC2細胞,于末次霧化后48h測定過繼性回輸ILC2后模型鼠氣道炎性細胞浸潤及肺部炎癥病理改變等相關(guān)指標。6、致敏前RSV感染對OVA哮喘鼠IL-33/ST2信號通路的影響采用實時定量熒光PCR技術(shù)檢測肺組織局部細胞因子IL-33及ST2L mRNA表達水平。7、IL-33/ST2信號通路對肺組織ILC2數(shù)量及活性的影響流式細胞儀檢測IL-33誘導(dǎo)后小鼠肺組織ILC2總數(shù)及分泌Th2型細胞因子的ILC2細胞數(shù)量。熒光定量PCR檢測封閉抗體阻斷ST2后ILC2細胞內(nèi)IL-4,IL-5及IL-13 mRNA表達情況。8、IL-33對ILC2細胞內(nèi)信號通路蛋白mRNA表達的影響為探討IL-33在小鼠肺組織ILC2細胞增殖和活化過程中是否依賴MAPKs及NF-κB信號途徑,采用實時熒光定量PCR檢測經(jīng)IL-33誘導(dǎo)后小鼠肺組織ILC2細胞內(nèi)ERK-1、ERK-2、IRAK-1、IRAK-4、TRAF-6、JNK-1、JNK-2、NF-kB、P38及MyD88 mRNA表達情況。9、統(tǒng)計學(xué)處理全部數(shù)據(jù)采用SPSSl6.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,統(tǒng)計結(jié)果表示為±S,采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異;當差異有統(tǒng)計學(xué)意義時,根據(jù)Levene法方差齊性檢驗結(jié)果使用Bonferroni或Games-Howell法進行組間比較,P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1、RSV感染減輕哮喘鼠氣道炎癥反應(yīng),降低哮喘鼠肺組織內(nèi)炎癥細胞數(shù)量。經(jīng)OVA致敏和激發(fā)的BALB/c鼠氣道上皮增厚、管腔狹窄、肺組織內(nèi)炎性細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞數(shù)量明顯增加。致敏前感染RSV可以抑制OVA誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng),減輕模型鼠肺組織內(nèi)炎性細胞浸潤。2、RSV感染影響哮喘鼠肺泡灌洗液中Thl/Th2型細胞因子含量致敏前RSV感染明顯下調(diào)哮喘鼠肺泡灌洗液中IL-5及IL-13的含量,但增加了肺泡灌洗液中IFN-γ的含量。3、RSV感染影響哮喘鼠肺組織Thl/Th2型細胞因子mRNA表達致敏前RSV感染明顯抑制哮喘鼠肺組織細胞IL-4,IL-5及IL-13 mRNA的表達,但增強肺局部IFN-γmRNA表達水平。4、RSV感染降低哮喘鼠肺組織內(nèi)ILC2細胞總數(shù)及分泌Th2型細胞因子的ILC2細胞數(shù)量致敏前感染RSV顯著降低哮喘鼠肺組織內(nèi)ILC2細胞總數(shù),分泌IL-4,IL-5和IL-13的活化ILC2細胞數(shù)亦因RSV感染而明顯下降。5、致敏前RSV感染影響哮喘鼠肺組織ILC2細胞中Th2型細胞因子mRNA表達.致敏前RSV感染明顯抑制哮喘鼠肺組織ILC2細胞IL-4、IL-5及IL-13 mRNA的表達6、ILC2細胞參與RSV感染對哮喘鼠氣道變態(tài)炎癥的影響作用RSV/OVA小鼠回輸了ILC2細胞后,肺炎性細胞數(shù)量明顯上升,其中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞百分比增加明顯。肺泡灌洗液中Th2型細胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)含量升高,肺組織中Th2型細胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)mRNA表達增強,而Th1型細胞因子IFN-γ在肺泡灌洗液中的含量下降,肺組織中mRNA表達減弱,證實ILC2細胞參與RSV感染對哮喘鼠氣道變態(tài)炎癥的影響作用。7、RSV感染降低哮喘鼠肺組織IL-33/ST2L mRNA的表達在本研究中我們利用實時定量熒光PCR技術(shù)分析了小鼠肺組織IL-33和ST2LmRNA表達情況,結(jié)果顯示,與OVA組相比,RSV/OVA組小鼠肺組織IL-33和ST2LmRNA表達下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。8、IL-33/ST2信號通路誘導(dǎo)BALB/c鼠肺組織ILC2的活化為進一步證實IL-33/ST2信號通路在小鼠肺組織ILC2細胞增殖和活化中的作用,采用流式細胞術(shù)檢測IL-33誘導(dǎo)后小鼠肺組織ILC2數(shù)量及分泌Th2型細胞因子的情況,結(jié)果顯示IL-33顯著增加了肺組織中ILC2數(shù)量,并上調(diào)了分泌IL-5及IL-13的ILC2數(shù)量,對ILC2細胞具有一定的激活作用。而阻斷ST2受體可以抑制ILC2細胞內(nèi)IL-4、IL-5及IL-13的mRNA表達。9、IL-33活化ILC2細胞依賴MAPKs信號通路IL-33可以增加ILC2細胞內(nèi)MAPK信號途徑MyD88、IRAK-4及P38信號因子mRNA表達。結(jié)論:1、致敏前RSV感染可以降低過敏原誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)。2、致敏前RSV感染通過下調(diào)IL-33/ST2信號通路改變ILC2細胞數(shù)量及其細胞因子分泌活性,左右氣道變態(tài)炎癥反應(yīng)過程。3、IL-33對ILC2細胞活化作用依賴于MAPKs信號途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R562.25
【圖文】：

1 致敏前 RSV 感染減少哮喘鼠肺組織炎性細胞浸潤如圖所示，MOCK 組小鼠肺組織細支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，細支氣管整齊，管腔圓整。周圍血管和支氣管偶見極少量炎性細胞，但未見嗜酸性無明顯炎癥反應(yīng)，氣管平滑肌及基底層無增厚，基底膜較薄，周圍組織無水RSV 組小鼠肺泡充血、增厚、斷裂；細支氣管及伴行血管周圍有少量炎性，主要是淋巴細胞及中性粒細胞；肺炎癥反應(yīng)較 OVA 哮喘組輕。OVA 組小鼠支氣管管壁增厚、管腔狹窄，細支氣管及伴行血管周圍可見以細胞、淋巴細胞為主的大量炎癥細胞浸潤，支氣管粘膜皺壁減少，管腔內(nèi)栓，杯狀細胞增生，肺泡間隔不同程度增寬，部分斷裂，形成肺氣腫。RSV/OVA 組小鼠氣道上皮增厚，管腔明顯狹窄，細支氣管壁及其周圍大量胞浸潤，肺炎癥反應(yīng)較 RSV 組更重，但較 OVA 組有所減輕。MOCKRSV

大量杯狀細胞增生及黏液分泌，AB-PAS 染色胞漿呈紫紅色，而經(jīng) RSV 感染后，杯狀細胞增生減輕、黏蛋白分泌減少。圖3.2 致敏前RSV感染減輕OVA哮喘鼠氣道杯狀細胞黏液蛋白的分泌（×200）圖中MOCK代表正常對照組，RSV代表單純RSV感染組，OVA代表OVA哮喘組，RSV/OVA代表 OVA 致敏前感染 RSV 的 RSV 感染哮喘組，采用 PAS 染色觀察肺組織杯狀細胞增生和黏液蛋白分泌。3.3 致敏前 RSV 感染降低哮喘鼠肺組織炎癥細胞數(shù)量小鼠肺泡灌洗液（BALF）細胞分類計數(shù)結(jié)果如下（圖 3.3）：細胞總數(shù)：與 MOCK 組相比，RSV 組、OVA 組及 RSV/OVA 組小鼠 BALF 中細胞總數(shù)均有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中RSV組、RSV/OVA組細胞總數(shù)升高幅度小于 OVA 組，與 OVA 組比較

IFN-γ：與 MOCK 組相比，RSV 組及 RSV/OVA 組 IFN-γ 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。OVA 組 IFN-γ 水平與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與RSV 組及RSV/OVA組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05（）圖3.4D）。3.5 致敏前 RSV 感染影響哮喘鼠肺組織 Th1/Th2 型細胞因子 mRNA 表達通過實時定量熒光 PCR 檢測肺組織 Th1/Th2 型細胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 以及 IFN-γmRNA 表達，結(jié)果顯示：相較于 MOCK 組，OVA 組及 RSV/OVA 組肺組織 IL-4，IL-5 及 IL-13 mRNA表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），證實 OVA 哮喘是以 Th2 型免疫反應(yīng)為主的氣道炎癥疾病。其中 OVA 組肺組織 IL-4，IL-5 及 IL-13 mRNA 表達水平均高于 RSV/OVA 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RSV 感染可以使小鼠肺組織 Th1 型細胞因子 IFN-γ 表達增強

【參考文獻】

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本文編號：2804067