【摘要】：線粒體疾病(mitochondriopathy diseases;MD)即因?yàn)檫z傳缺損而導(dǎo)致線粒體代謝酶缺陷,使得ATP合成障礙、能量來(lái)源不足,導(dǎo)致多系統(tǒng)疾病或組織特異性疾病,通常發(fā)生在多個(gè)系統(tǒng)參與并具有高能量需求的器官中,例如大腦,骨骼肌和心臟~([1])。線粒體和細(xì)胞核基因組的雙重參與導(dǎo)致了所有可能的遺傳模式——母系、X連鎖、常染色體隱性遺傳和常染色體顯性遺傳。目前,我們通過(guò)4例線粒體病家系驗(yàn)證已經(jīng)確定四個(gè)基因突變位點(diǎn),分別是PDHA1 c.262CT、ECHS1 c.5CT和c.563CT、WDR45 c.1040-1041del以及PERM1 c.87GT。因PDHA1、ECHS1和WDR45已有明確的突變致病機(jī)制研究,而PERM1突變?cè)趪?guó)內(nèi)外均無(wú)相關(guān)研究,因此本文選擇PERM1突變與線粒體病相關(guān)致病機(jī)制進(jìn)行深入研究。PERM1在細(xì)胞核中表達(dá)較高,在葡萄糖和脂質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)移、收縮功能、肌肉線粒體生物發(fā)生和氧化能力等方面發(fā)揮作用。PERM1單堿基突變導(dǎo)致線粒體病機(jī)制至今仍然不是完全清楚。關(guān)于PERM1基因相關(guān)分子機(jī)制的研究也鮮有報(bào)道。本文為進(jìn)一步研究PERM1基因突變導(dǎo)致線粒體病的分子機(jī)制,建立了PERM1突變的細(xì)胞模型,并進(jìn)行了相關(guān)線粒體方面的研究。1.我們從一個(gè)疑似患有MD的家系中,采集得到患者全血樣本,經(jīng)全外顯子組測(cè)序分析以及一代測(cè)序驗(yàn)證,確定了一個(gè)PERM1基因突變,該突變位于1號(hào)外顯子上即c.87GT(p.Q29H)。2.為進(jìn)一步探究PERM1基因突變致線粒體病的分子機(jī)制,本文在細(xì)胞水平上進(jìn)行相關(guān)研究。在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PERM1野生型質(zhì)粒和PERM1突變型質(zhì)粒,通過(guò)免疫熒光以及免疫印跡實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)較野生型PERM1蛋白相比,突變型PERM1蛋白減少,為了進(jìn)一步確定PERM1基因突變對(duì)細(xì)胞的影響,本文構(gòu)建了慢病毒系統(tǒng),并轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞和A204細(xì)胞,并篩選得出穩(wěn)定表達(dá)野生型和突變型PERM1蛋白的細(xì)胞株,通過(guò)免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)得出,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象一致,突變的PERM1蛋白較野生型PERM1蛋白減少。另外通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)PERM1突變型細(xì)胞與PERM1野生型細(xì)胞相比,突變的PERM1基因在轉(zhuǎn)錄水平上低于野生型,進(jìn)一步說(shuō)明突變型細(xì)胞中PERM1蛋白的減少可能是由于mRNA水平發(fā)生了降低。3.為了進(jìn)一步研究PERM1基因突變對(duì)線粒體相關(guān)功能的影響,我們利用構(gòu)建好的細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞一方面進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)突變型PERM1較野生型相比線粒體膜電位未發(fā)生明顯變化。另一方面通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)突變型PERM1可能增加mtDNA含量,另外通過(guò)觀察透射電鏡發(fā)現(xiàn),PERM1突變導(dǎo)致細(xì)胞線粒體的內(nèi)部形態(tài)發(fā)生改變,嵴數(shù)量減少,這在很大程度上與線粒體疾病的發(fā)生有關(guān)。由此得出,突變型PERM1較野生型相比其mRNA表達(dá)水平降低,且突變后PERM1蛋白分泌減少,證明了蛋白的減少可能是由于mRNA表達(dá)水平的降低。另外,通過(guò)線粒體相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了PERM1基因突變會(huì)影響線粒體相關(guān)結(jié)構(gòu)的改變。本文得出的數(shù)據(jù)可為臨床上診斷MD提供相關(guān)依據(jù),具有很大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R596
【圖文】：

PGC-1基因調(diào)控圖

圖 2.1 通過(guò) WES 確定患者致病突變位點(diǎn) PERM1 87G>T紅色背景代表堿基錯(cuò)配，黑框所圈位點(diǎn)為篩選出的可能致病的突變位點(diǎn)Figure 2.1 Determination of patient pathogenic mutation site PERM1 87G>T by WESThe red background represents the base mismatch, and the black box is the selected mutation site

圖 2.2 家系圖譜女性由圓形指代，男性由正方形指代，先證者由黑色填充指代，先證者由箭頭(DHA1 突變患者家系圖譜。B.WDR45 突變患者家系圖譜。C.PERM1 突變患者家D.ECHS1 突變患者家系圖譜。Figure. 2.2 Family map.Females are referred to by circles, men are represented by squares, patients are refer

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本文編號(hào)：2801048