【摘要】：目 的隨著人口老齡化問題日益嚴(yán)重,骨質(zhì)疏松及其骨折已經(jīng)成為一種嚴(yán)重影響老年人健康的疾病。已知花色苷類化合物具有抗骨質(zhì)疏松作用,但目前尚不清楚其對骨質(zhì)疏松癥發(fā)展過程有重要作用的成骨細(xì)胞增殖或分化的影響。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑對成骨細(xì)胞內(nèi)增殖和分化等信號傳遞具有重要作用。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-Glucoside,C3G)屬于花色苷類物質(zhì),在RAW264.7和平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中經(jīng)MAPK途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。本次研究擬采用原代人成骨細(xì)胞和小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1兩種細(xì)胞模型,觀察C3G對成骨細(xì)胞的增殖、分化及MAPK在C3G調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能過程中的作用。方 法采用來自髖部骨折后行人工股骨頭置換術(shù)的骨質(zhì)疏松患者股骨頭松質(zhì)骨組織,通過膠原酶-透明質(zhì)酸酶消化提取原代成骨細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng),至第3代使用。茜素紅染色誘導(dǎo)礦化實(shí)驗(yàn)對提取的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。使用MTT 比色法評價不同濃度C3G(0-40μmol/L)處理兩種成骨細(xì)胞,計(jì)算24h、48h、72h時各濃度組細(xì)胞增殖率。使用實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)技術(shù)對使用不同濃度C3G(0-200μmol/L)處理的MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活性進(jìn)行實(shí)時跟蹤48h并繪制期間時間-細(xì)胞指數(shù)曲線。使用ERK1/2特異性抑制劑PD98059、JNK特異性抑制劑SP600125、P38特異性抑制劑SB202192分別預(yù)處理兩種成骨細(xì)胞4h后,使用0μmol/L或100μmol/L濃度C3G處理兩種成骨細(xì)胞24h并計(jì)算各組成骨細(xì)胞增殖率。使用不同濃度的C3G(0-200μmol/L)處理人原代成骨細(xì)胞7d,茜素紅染色后觀察礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生密度。使用不同濃度的C3G(0-200μmol/L)處理MC3T3-E1細(xì)胞24h,ELISA法測定骨鈣素(Osteocalcin,OC)、Ⅰ型膠原蛋白羧基末端交聯(lián)(C-Terminal Telopeptide of Type Ⅰ Collagen,CTX-I)水平,比色法測定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。使用0μmol/L或lOOμmol/L濃度的C3G處理MC3T3-E1細(xì)胞24h,實(shí)時熒光定量PCR法測定ALP、Runx2、BMP2 mRNA表達(dá)水平;使用如前所述抑制劑預(yù)處理方案及C3G處理方案處理后,測定OC、RSK2、ATF4、ATF2、OSX、FOXO1、DLX5 mRNA表達(dá)水平;Western Blot法測定ERK1/2、JNK、P38的豐度及磷酸化水平。結(jié) 果1.人成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定股骨頭松質(zhì)骨組織經(jīng)膠原酶-透明質(zhì)酸酶消化后獲得成骨細(xì)胞,原代成骨細(xì)胞24h后貼壁,細(xì)胞呈梭形,部分區(qū)域呈集落生長,細(xì)胞爬滿瓶底需約7-14d。傳代后細(xì)胞貼壁時間較原代細(xì)胞短,增殖速度較穩(wěn)定,約7d鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底,細(xì)胞呈長梭形和多角形,胞漿豐富,細(xì)胞內(nèi)單核,低倍鏡下細(xì)胞呈現(xiàn)“渦輪”狀生長。誘導(dǎo)礦化處理后,茜素紅染色呈陽性。2.C3G處理對MC3T3-E1細(xì)胞及人成骨細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示C3G處理后兩種細(xì)胞增殖率均上升,C3G各濃度組與對照組相比差異顯著(P0.05)。隨著時間延長,C3G各濃度組與對照組之間的差距逐漸減小,在72h時C3G 25μmol/L和500μmol/L濃度組與對照組之間的差距消失(P0.05),但200μmol/L和400μmol/L對成骨細(xì)胞增殖能力依然有一定的增強(qiáng)作用(P0.05)。RTCA結(jié)果顯示,C3G提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù),其中C3G處理的24h時效果明顯。3.MAPK信號通路抑制劑預(yù)處理后C3G對成骨細(xì)胞增殖的影響與DMSO-對照組相比,DMSO-C3G組細(xì)胞增殖率顯著提高(P0.001)。在PD98059、SB202192或SP600125處理后,各抑制劑-C3G組與其抑制劑-對照組相比,細(xì)胞增殖率均仍舊顯著提高(P0.001)。4.C3G處理對人成骨細(xì)胞礦化能力的影響C3G處理7d,人原代成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)密度改變,與對照組相比100μmol/L和2000μmol/L組鏡下檢視可觀察到更多紅染結(jié)構(gòu)。5.C3G處理對MC3T3-E1細(xì)胞ALP、OC和CTX-I的影響在C3G處理24h后,細(xì)胞內(nèi)ALP活性和CTX-1水平隨著C3G濃度的增加而略有下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對照組比較,C3G處理各組OC濃度均顯著增加(P0.05)。6.C3G處理對MC3T3-E1細(xì)胞ALP、BMP-2和Runx2 mRNA表達(dá)的影響C3G處理的各組與對照組相比,細(xì)胞內(nèi)ALP mRNA水平顯著下降,差異倍數(shù)(Fold Change,FC)=0.55(P0.05);BMP mRNA水平無明顯改變,FC=1.05(P=0.86);Runx2 mRNA水平顯著下降,FC=0.35(P0.05)。7.抑制劑預(yù)處理后C3G對MC3T3-E1 細(xì)胞OC、RSK2、ATF4、ATF2、OSX、FOXOl、DLX5 mRNA表達(dá)的影響在無抑制劑預(yù)處理組中(DMSO-對照組和DMSO-C3G組比較),各基因表達(dá)水平:ATF4(FC=1.15,P0.05)、OC(FC=1.73,P0.05)、DLX5(FC=1.26,P0.01)和FOX O1(FC=1.30,P0.05)。PD98059預(yù)處理后C3G組與抑制劑-對照組相比OC(FC=0.99,P=0.93)和ATF4(FC=1.05,P=0.70)mRNA表達(dá)水平差異消失。抑制劑-對照組與DMSO-對照組相比RSK2 mRNA水平顯著升高(FC=1.90,P0.01),C3G組無此變化。SB202192預(yù)處理后,C3G組與抑制劑-對照組相比OSX(FC=2.11,P0.01)、DLX5(FC=1.32,P0.01)表達(dá)水平升高。SP600125預(yù)處理后,C3G組FOX O1(FC=1.31,P=0.13)和ATF2(FC=1.30,P=0.52)mRNA水平與抑制劑-對照組相比均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8.C3G對MC3T3-E1細(xì)胞中MAPK通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響C3G處理后ERK1/2磷酸化水平上升(P0.05),JNK(P=0.27)及P38(P=0.6)磷酸化水平無明顯改變�？侲RK1/2(P=0.08)、JKN(P=0.31)、P38(P=0.64)水平與對照組相比均無明顯改變。結(jié) 論1.C3G能夠在體外條件下促進(jìn)人原代成骨細(xì)胞和小鼠源成骨細(xì)胞株MC3T3-E1增殖。2.C3G能夠降低成骨細(xì)胞分化早期的標(biāo)志性蛋白Runx2和ALP的mRNA表達(dá),提高成骨細(xì)胞分化晚期的標(biāo)志性蛋白OC表達(dá),并提高成骨細(xì)胞的礦化能力。3.C3G可能通過ERK1/2通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：沈陽醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580
【圖文】：

Ｂ２Ｂ３茜素紅染色（２０0ｘ）。逡逑二、Ｃ３Ｇ處理對ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞及人成骨細(xì)胞增殖的影響逡逑如圖２所示，ＭＴＴ結(jié)果顯示Ｃ３Ｇ處理后兩種細(xì)胞增殖率上升，與對照組相比逡逑差異顯著（／＞邋＜0．0５）。隨著時間延長，Ｃ３Ｇ各濃度組與對照組之間的差距逐漸減逡逑小，在７２ｈ時Ｃ３Ｇ邋２５（ｉｍｏｌ／Ｌ和５０［ｉｍｏｌ／Ｌ濃度組與對照組之間的差距消失（Ａ０．０５邋），逡逑但２００卜ｒｎｉｏｌ／Ｌ和４００ｐｍｏｌ／Ｌ對成骨細(xì)胞增殖能力依然有一定的增強(qiáng)作用（ＰＯ．０５邋）。逡逑ＲＴＣＡ結(jié)果與ＭＴＴ相似，如圖２．Ｃ所示，總計(jì)９６ｈ的記錄時間，其中０－２４ｈ逡逑為等待貼壁，２４－４８ｈ為無血清同步化處理，４８－９６ｈ為Ｃ３Ｇ處理階段。因此在觀察逡逑結(jié)也時Ｃ３Ｇ處理細(xì)胞的時長為４８ｈ。從曲線可以直觀地看出，在Ｃ３Ｇ處理的前逡逑２４ｈ各濃度組細(xì)胞指數(shù)顯著加大，而后２４ｈ則穩(wěn)步上升，各組間差距逐漸收窄。細(xì)逡逑胞指數(shù)曲線的波浪狀浮動為換液時開關(guān)培養(yǎng)箱導(dǎo)致二氧化碳濃度變化從而影響微逡逑孔板信號采集。逡逑２６逡逑

四、Ｃ３Ｇ處理對人成骨細(xì)胞礦化能力的影響逡逑如圖４所示，使用含有Ｃ３Ｇ的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)成骨細(xì)胞７ｄ后，各濃度組細(xì)逡逑胞的鈣化結(jié)節(jié)密度如照片所示。顯微鏡的放大倍數(shù)調(diào)整為４0ｘ，并且鏡頭位于培逡逑養(yǎng)孔的正中心。中濃度（ｌＯＯ＾ｍｏｌ／Ｌ）和低濃度（５0ｎｍｏｌ／Ｌ）的Ｃ３Ｇ與對照組相逡逑比呈現(xiàn)出礦化能力增強(qiáng)的趨勢。與對照組或中濃度、低濃度組相比，高Ｃ３Ｇ濃度逡逑（２００ｐｍｏｌ／邋Ｌ）的人原代成骨細(xì)胞能產(chǎn)生更多紅染的鈣化點(diǎn)。逡逑

圖５邋Ａ不同濃度Ｃ３Ｇ處理后細(xì)胞內(nèi)ＡＬＰ活性情況（ｎ＝４）。Ｂ不同濃度Ｃ３Ｇ處逡逑細(xì)胞內(nèi)ＣＴＸ－丨水平（ｎ＝４）。Ｃ不同濃度Ｃ３Ｇ處理后細(xì)胞內(nèi)ＯＣ水平（ｎ＝４）。逡逑＊尸＜０．０５；邋＊＊尸＜０．０７；均為與Ｃ３Ｇ濃度０（ｉｍｏｌ／Ｌ組比較。逡逑Ｃ３Ｇ處理對ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞ＡＬＰ、ＢＭＰ－２和Ｒｕｎｘ２邋ｍＲＮＡ表達(dá)的逡逑３０逡逑

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