【摘要】：研究背景:激素抵抗型哮喘嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),尋找有效地治療是亟待解決的關(guān)鍵性問題。哮喘激素抵抗的機(jī)制之一是過度激活的炎癥因子導(dǎo)致的氣道上皮細(xì)胞壞死性凋亡。粘蛋白1(MUC1),廣泛表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞,具有抑制炎癥和細(xì)胞死亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)重癥哮喘中,MUC1缺失顯著抑制地塞米松(Dex)的抗炎作用。然而,MUC1與Dex介導(dǎo)的抗壞死性凋亡之間的作用與機(jī)制目前尚未有研究。目的:探究MUC1下調(diào)是否減弱Dex對(duì)氣道上皮細(xì)胞的抗壞死性凋亡作用,并闡釋其潛在機(jī)制。方法:將MUC1小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE),然后用腫瘤壞死因子(TNF-α)、Dex刺激。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的壞死性凋亡情況,免疫印跡檢測(cè)MUC1、糖皮質(zhì)激素受體(GR)α、GRβ、核因子-κB(NF-κB p65)、磷酸化核因子-κB(p-p65)和組蛋白脫乙酰酶-2(HDAC2)的蛋白表達(dá)。另外,通過免疫熒光分析MUC1和GRα的核轉(zhuǎn)位。結(jié)果:TNF-α能誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡;MUC1下調(diào)加重TNF-α誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,然而其效應(yīng)不能被Dex抑制;另外,我們發(fā)現(xiàn)MUC1下調(diào)抑制GRα核轉(zhuǎn)運(yùn),并且能減弱Dex對(duì)p-p65的抑制作用。結(jié)論:MUC1下調(diào)促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,Dex不能抑制其加重的細(xì)胞壞死性凋亡。此外,在TNF-α誘導(dǎo)壞死性凋亡中,MUC1可通過抑制GRα核轉(zhuǎn)運(yùn)和減弱Dex對(duì)p-p65的抑制作用致激素抵抗形成。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R562.25
【圖文】：

26圖 3：激素抵抗與 GRα和 GRβ蛋白表達(dá)無關(guān)。將小干擾 RNA（MUC1-siRNA 和陰性對(duì)照 scrambled siRNA）轉(zhuǎn)染至 16HBE 細(xì)胞，然后用 TNF-α（300 ng/mL）處理 24 小時(shí)。（A，B）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè) GRα表達(dá)。（C，D）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè) GRβ表達(dá)。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差顯示（n=3），并用 ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*P < 0.05。NC組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 scrambled siRNA）；MUC1-siRNA 組（轉(zhuǎn)染 MUC1-siRNA）。抑制。另外，TNF-α能減弱地塞米松對(duì) GRα核轉(zhuǎn)位的正調(diào)控作用，然而這種趨勢(shì)未能在 MUC1 下調(diào)的 16HBE 細(xì)胞中顯現(xiàn)（圖 4A）。為進(jìn)一步證實(shí) MUC1 下調(diào)能抑制 GRα核轉(zhuǎn)位，我們分別檢測(cè)胞質(zhì)和胞核中 GRα的表達(dá)。Western blot 結(jié)果顯示，與 MUC1-siRNA 組相比，

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文Dex 增加了陰性對(duì)照組中 GRα核蛋白表達(dá)。而與 NC + Dex 組相比，MUC1-siRNA+ Dex 組中 GRα核蛋白表達(dá)減少。另外，我們通過共聚焦顯微鏡探究 MUC1 和 GRα的亞細(xì)胞定位。如圖 4C 所示，在基礎(chǔ)條件下，MUC1 和 GRα定位于 16HBE 細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中，而在 Dex 處理后，胞核中 MUC1 與 GRα共表達(dá)增加。總之，這些數(shù)據(jù)提示 MUC1 下調(diào)能抑制GRα核轉(zhuǎn)位來降低 GC 敏感性（圖 6）。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文熒光分析 GRα的分布。（B）Western blot 檢測(cè)胞質(zhì)和胞核中 GRα的表達(dá)。（C）1 μMDex 處理 16HBE 細(xì)胞 12 小時(shí)后，免疫熒光分析 MUC1 和 GRα的分布。數(shù)據(jù)以均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差顯示（n=3），并用 ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*P < 0.05；**P < 0.01。Scale bar= 50 μm。Dex（地塞米松）；NC 組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 scrambled siRNA）；MUC1-siRNA組（轉(zhuǎn)染 MUC1-siRNA）。5.MUC1 下調(diào)通過抑制 p-p65 表達(dá)減弱糖皮質(zhì)激素敏感性目前，廣泛接受NF-κB p65和HDAC2信號(hào)通路參與激素抵抗的形成，為此，我們繼續(xù)探究 MUC1 下調(diào)是否會(huì)激活以上兩種信號(hào)通路。我們發(fā)

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本文編號(hào)：2799419