【摘要】：研究背景:激素抵抗型哮喘嚴重影響患者生活質(zhì)量和增加患者經(jīng)濟負擔,尋找有效地治療是亟待解決的關(guān)鍵性問題。哮喘激素抵抗的機制之一是過度激活的炎癥因子導致的氣道上皮細胞壞死性凋亡。粘蛋白1(MUC1),廣泛表達于氣道上皮細胞,具有抑制炎癥和細胞死亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)重癥哮喘中,MUC1缺失顯著抑制地塞米松(Dex)的抗炎作用。然而,MUC1與Dex介導的抗壞死性凋亡之間的作用與機制目前尚未有研究。目的:探究MUC1下調(diào)是否減弱Dex對氣道上皮細胞的抗壞死性凋亡作用,并闡釋其潛在機制。方法:將MUC1小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細胞(16HBE),然后用腫瘤壞死因子(TNF-α)、Dex刺激。流式細胞儀分析細胞的壞死性凋亡情況,免疫印跡檢測MUC1、糖皮質(zhì)激素受體(GR)α、GRβ、核因子-κB(NF-κB p65)、磷酸化核因子-κB(p-p65)和組蛋白脫乙酰酶-2(HDAC2)的蛋白表達。另外,通過免疫熒光分析MUC1和GRα的核轉(zhuǎn)位。結(jié)果:TNF-α能誘導16HBE細胞發(fā)生壞死性凋亡;MUC1下調(diào)加重TNF-α誘導的16HBE細胞發(fā)生壞死性凋亡,然而其效應不能被Dex抑制;另外,我們發(fā)現(xiàn)MUC1下調(diào)抑制GRα核轉(zhuǎn)運,并且能減弱Dex對p-p65的抑制作用。結(jié)論:MUC1下調(diào)促進TNF-α誘導16HBE細胞發(fā)生壞死性凋亡,Dex不能抑制其加重的細胞壞死性凋亡。此外,在TNF-α誘導壞死性凋亡中,MUC1可通過抑制GRα核轉(zhuǎn)運和減弱Dex對p-p65的抑制作用致激素抵抗形成。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R562.25
【圖文】：

26圖 3：激素抵抗與 GRα和 GRβ蛋白表達無關(guān)。將小干擾 RNA（MUC1-siRNA 和陰性對照 scrambled siRNA）轉(zhuǎn)染至 16HBE 細胞，然后用 TNF-α（300 ng/mL）處理 24 小時。（A，B）實時熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 GRα表達。（C，D）實時熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 GRβ表達。數(shù)據(jù)以均值 ± 標準差顯示（n=3），并用 ANOVA 進行統(tǒng)計學分析，*P < 0.05。NC組（轉(zhuǎn)染陰性對照 scrambled siRNA）；MUC1-siRNA 組（轉(zhuǎn)染 MUC1-siRNA）。抑制。另外，TNF-α能減弱地塞米松對 GRα核轉(zhuǎn)位的正調(diào)控作用，然而這種趨勢未能在 MUC1 下調(diào)的 16HBE 細胞中顯現(xiàn)（圖 4A）。為進一步證實 MUC1 下調(diào)能抑制 GRα核轉(zhuǎn)位，我們分別檢測胞質(zhì)和胞核中 GRα的表達。Western blot 結(jié)果顯示，與 MUC1-siRNA 組相比，

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文Dex 增加了陰性對照組中 GRα核蛋白表達。而與 NC + Dex 組相比，MUC1-siRNA+ Dex 組中 GRα核蛋白表達減少。另外，我們通過共聚焦顯微鏡探究 MUC1 和 GRα的亞細胞定位。如圖 4C 所示，在基礎(chǔ)條件下，MUC1 和 GRα定位于 16HBE 細胞的胞質(zhì)和胞核中，而在 Dex 處理后，胞核中 MUC1 與 GRα共表達增加。總之，這些數(shù)據(jù)提示 MUC1 下調(diào)能抑制GRα核轉(zhuǎn)位來降低 GC 敏感性（圖 6）。

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文熒光分析 GRα的分布。（B）Western blot 檢測胞質(zhì)和胞核中 GRα的表達。（C）1 μMDex 處理 16HBE 細胞 12 小時后，免疫熒光分析 MUC1 和 GRα的分布。數(shù)據(jù)以均值 ±標準差顯示（n=3），并用 ANOVA 進行統(tǒng)計學分析，*P < 0.05；**P < 0.01。Scale bar= 50 μm。Dex（地塞米松）；NC 組（轉(zhuǎn)染陰性對照 scrambled siRNA）；MUC1-siRNA組（轉(zhuǎn)染 MUC1-siRNA）。5.MUC1 下調(diào)通過抑制 p-p65 表達減弱糖皮質(zhì)激素敏感性目前，廣泛接受NF-κB p65和HDAC2信號通路參與激素抵抗的形成，為此，我們繼續(xù)探究 MUC1 下調(diào)是否會激活以上兩種信號通路。我們發(fā)

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本文編號：2799419