【摘要】：背景糖尿病腎病(diabetes nephropathy,DN)是糖尿病最為常見的微血管并發(fā)癥之一。目前,DN的發(fā)病復雜,其機制尚不完全清楚。既往認為腎小球損傷是在糖尿病腎病發(fā)展為終末期腎病(ESRD)過程中最重要的病理變化。然而,腎小管及腎間質占全部腎臟體積的90%左右,腎小管細胞的損傷在DN發(fā)病過程中起著同樣重要作用。越來越多的證據表明,在腎小球濾過正常的時候,腎小管性蛋白尿已經可以在尿液中檢測到,這就說明腎小管在DN發(fā)病機制中獨立于腎小球的改變,腎小管細胞受損是DN早期的原始改變,阻斷腎小管近端上皮細胞受損更接近于治療靶點的源頭。自噬(autophagy)是細胞通過溶酶體降解自身受損細胞器以及大分子物質的過程,在腎臟疾病中起著重要的作用。自噬分為選擇性自噬和非選擇性自噬。其中,機體通過選擇性自噬清除各種細胞器如線粒體、內質網、過氧化物酶體等,分別稱為線粒體自噬、內質網自噬、過氧化物酶體自噬等。正常情況下,細胞自噬功能處于一個正常的基礎水平,來維持細胞正常的生理功能。若機體自噬出現(xiàn)異常,則可能會導致腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前,調控腎小管上皮細胞線粒體自噬的機制不太清楚。叉頭狀轉錄調節(jié)因子O1(forkhead transcription factors of the O class1)在抗氧化應激、轉錄翻譯、糖脂代謝等方面具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),FoxO1可以調節(jié)線粒體自噬,減少ROS的過度釋放,進而改善糖尿病足細胞氧化應激損傷。腎小管細胞中的研究發(fā)現(xiàn),高糖會導致腎小管上皮細胞自噬功能的下降,可能與DN的發(fā)病機制可能有密切的關系。BNIP3屬于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亞家族,研究發(fā)現(xiàn)BNIP3可以激活線粒體自噬,既往研究發(fā)現(xiàn)在急性腎損傷的腎近曲小管細胞中,FoxOs可以通過下游靶基因Bnip3抑制mTORC1的作用,開始自噬,促進凋亡。由此我們推斷,FoxO1/Bnip3通路在糖尿病腎病的腎小管中也可能發(fā)揮重要作用。FoxO1可以通過上調Bnip3的表達,啟動線粒體自噬,減少損傷。目的:在前期研究工作的基礎上,結合國內外最新研究成果,擬通過體內和體外在高糖條件下,觀察調節(jié)FoxO1的表達對線粒體自噬和在近端腎小管損傷中的影響,并探究其是否通過激活下游BNIP3的表達發(fā)揮作用,為DN的防治提供新的思路。方法:動物實驗部分,利用雄性C57BL/6野生小鼠和同型FoxO1過表達的轉基因小鼠,通過STZ誘導建立糖尿病小鼠模型。實驗小鼠分為4組,普通小鼠對照組(NG)、轉基因小鼠正常組(TG)、普通糖尿病小鼠(DM)、轉基因糖尿病小鼠(TG-DM)。每組各8只。12周末小鼠心臟取血檢測血清肌酐、尿素氮;各組代謝籠收集24h尿檢測24h尿總蛋白、尿微量白蛋白;尾靜脈取血測血糖,小鼠麻醉后,迅速剝離出腎臟,其中放入4%戊二醛中固定用于電子顯微鏡的檢查,置于4%多聚甲醛中固定用于石蠟切片,剩余放入凍存管于液氮中冷凍,Western blot檢測FoxO1表達水平及磷酸化狀態(tài)(p-FoxO1)、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平;免疫組化檢測FOXO1、BNIP3在各組大鼠腎組織中的表達。透射電鏡、HE染色、Massion染色觀察腎臟的病理學變化。使用CRISPR/Cas9技術在腎小管上皮細胞上過表達/敲除FoxO1,使用BNIP3 siRNA質粒轉染。細胞實驗分組如下:(1)正常糖濃度組(NG,5.6mmol/L),(2)高糖(HG,25mmol/L),(3)高糖+FoxO1上調組(HG+KI),(4)Bnip3 siRNA轉染組(HG+KI+Bnip3 siRNA)。各組處理后實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各組FoxO1、BNIP3、LC3、P62 mRNA的表達水平。Western blot檢測FoxO1表達水平及磷酸化狀態(tài)(p-FoxO1)、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平;免疫熒光化學檢測各組細胞FoxO1和BNIP3的表達;流式細胞儀檢測各組ROS的生成率;檢測各組細胞ATP的生產率。。結果:1.小鼠各組腎臟腎小管上皮細胞中FoxO1的表達以及活性的改變,與NG組相比,DM組小鼠腎臟腎小管上皮細胞中FoxO1蛋白水平沒有統(tǒng)計學差異(P0.05),p-FoxO1/FoxO1蛋白水平增高(P0.05),與DM組相比,TG-DM組FoxO1蛋白水平增高(P0.05),p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05)。表示高糖可以誘導FoxO1轉錄活性下降,轉基因小鼠FoxO1上調成功。2.動物驗證FoxO1對BNIP3通路的影響,與NG組相比,DM組BNIP3蛋白水平降低,LC3、P62蛋白水平均明顯升高(P0.05),與DM組相比,TG-DM組BNIP3蛋白水平升高,LC3、P62蛋白水平均降低(P0.05)。HE和掃描電鏡染色顯示TG-DM組腎小管結構等病變均較DM組有所減輕。3.細胞各組FoxO1表達以及活性的改變:與NG組相比,HG組FoxO1 mRNA及蛋白水平無明顯變化,p-FoxO1/FoxO1水平增高(P0.05)。HG+KI組較HG組FoxO1 mRNA及蛋白水平升高,p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05)。說明高糖可以誘導FoxO1轉錄活性下降,CRISPR/Cas9技術在腎小管上皮細胞過表達FoxO1成功。4.細胞中FoxO1對BNIP3通路的影響:與NG組相比,HG組BNIP3 mRNA及蛋白水平降低,LC3、P62 mRNA及蛋白水平均升高(P0.05),與HG組相比,HG+KI組BNIP3 mRNA及蛋白水平升高,LC3、P62 mRNA及蛋白水平均有所降低(P0.05)。轉染BNIP3敲除的質粒后,上調FoxO1對上述指標的影響被阻斷。5.與NG組相比,HG組明顯升高腎小管上皮細胞中ROS水平(P0.05),與HG組相比,HG+KI組可顯著抑制高糖的影響(P0.05),轉染BNIP3敲除的質粒后,上調FoxO1對上述指標的影響被阻斷。結論:(1)高糖能夠降低腎小管上皮細胞中FOXO1表達活性,導致線粒體功能障礙,引起細胞內ROS的增加。(2)過表達FoxO1可以明顯提高高糖狀態(tài)下HK-2細胞線粒體自噬水平,降低高糖誘導的線粒體損傷,其機制可能是通過上調BNIP3實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：
圖 1 各組 HK-2 細胞 FoxO1 及 p-FoxO1 表達A：FoxOl mRNA 相對表達量；B：Western blot 檢測 FoxO1 及 p-FoxO1 水平；C: FoxO1 蛋白相對表達水平； D: p-FoxO1/FoxO1 的比值。*表示與 NG 組相比，P<0.05； #表示與 HG 組相比，P<0.05
免疫熒光化學檢測各組細胞FoxO1表達*表示與NG組相比，P<0.05；#表示與HG組相比，P<0.05
圖 3 各組 HK-2 細胞 BNIP3、P62 和 LC3 mRNA 相對表達量A：BNIP3 mRNA 表達；B：P62 mRNA 表達；C：LC3 mRNA 表達*表示與 NG 組相比，P<0.05； #表示與 HG 組相比，P<0.05；&表示與 HG+KI 組相比，P<0.05
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本文編號：2790985
