【摘要】：背景糖尿病腎病(diabetes nephropathy,DN)是糖尿病最為常見的微血管并發(fā)癥之一。目前,DN的發(fā)病復(fù)雜,其機(jī)制尚不完全清楚。既往認(rèn)為腎小球損傷是在糖尿病腎病發(fā)展為終末期腎病(ESRD)過程中最重要的病理變化。然而,腎小管及腎間質(zhì)占全部腎臟體積的90%左右,腎小管細(xì)胞的損傷在DN發(fā)病過程中起著同樣重要作用。越來越多的證據(jù)表明,在腎小球?yàn)V過正常的時(shí)候,腎小管性蛋白尿已經(jīng)可以在尿液中檢測到,這就說明腎小管在DN發(fā)病機(jī)制中獨(dú)立于腎小球的改變,腎小管細(xì)胞受損是DN早期的原始改變,阻斷腎小管近端上皮細(xì)胞受損更接近于治療靶點(diǎn)的源頭。自噬(autophagy)是細(xì)胞通過溶酶體降解自身受損細(xì)胞器以及大分子物質(zhì)的過程,在腎臟疾病中起著重要的作用。自噬分為選擇性自噬和非選擇性自噬。其中,機(jī)體通過選擇性自噬清除各種細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體等,分別稱為線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、過氧化物酶體自噬等。正常情況下,細(xì)胞自噬功能處于一個(gè)正常的基礎(chǔ)水平,來維持細(xì)胞正常的生理功能。若機(jī)體自噬出現(xiàn)異常,則可能會導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前,調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制不太清楚。叉頭狀轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子O1(forkhead transcription factors of the O class1)在抗氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄翻譯、糖脂代謝等方面具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),FoxO1可以調(diào)節(jié)線粒體自噬,減少ROS的過度釋放,進(jìn)而改善糖尿病足細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。腎小管細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),高糖會導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞自噬功能的下降,可能與DN的發(fā)病機(jī)制可能有密切的關(guān)系。BNIP3屬于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亞家族,研究發(fā)現(xiàn)BNIP3可以激活線粒體自噬,既往研究發(fā)現(xiàn)在急性腎損傷的腎近曲小管細(xì)胞中,FoxOs可以通過下游靶基因Bnip3抑制mTORC1的作用,開始自噬,促進(jìn)凋亡。由此我們推斷,FoxO1/Bnip3通路在糖尿病腎病的腎小管中也可能發(fā)揮重要作用。FoxO1可以通過上調(diào)Bnip3的表達(dá),啟動(dòng)線粒體自噬,減少損傷。目的:在前期研究工作的基礎(chǔ)上,結(jié)合國內(nèi)外最新研究成果,擬通過體內(nèi)和體外在高糖條件下,觀察調(diào)節(jié)FoxO1的表達(dá)對線粒體自噬和在近端腎小管損傷中的影響,并探究其是否通過激活下游BNIP3的表達(dá)發(fā)揮作用,為DN的防治提供新的思路。方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分,利用雄性C57BL/6野生小鼠和同型FoxO1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,通過STZ誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型。實(shí)驗(yàn)小鼠分為4組,普通小鼠對照組(NG)、轉(zhuǎn)基因小鼠正常組(TG)、普通糖尿病小鼠(DM)、轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠(TG-DM)。每組各8只。12周末小鼠心臟取血檢測血清肌酐、尿素氮;各組代謝籠收集24h尿檢測24h尿總蛋白、尿微量白蛋白;尾靜脈取血測血糖,小鼠麻醉后,迅速剝離出腎臟,其中放入4%戊二醛中固定用于電子顯微鏡的檢查,置于4%多聚甲醛中固定用于石蠟切片,剩余放入凍存管于液氮中冷凍,Western blot檢測FoxO1表達(dá)水平及磷酸化狀態(tài)(p-FoxO1)、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平;免疫組化檢測FOXO1、BNIP3在各組大鼠腎組織中的表達(dá)。透射電鏡、HE染色、Massion染色觀察腎臟的病理學(xué)變化。使用CRISPR/Cas9技術(shù)在腎小管上皮細(xì)胞上過表達(dá)/敲除FoxO1,使用BNIP3 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)正常糖濃度組(NG,5.6mmol/L),(2)高糖(HG,25mmol/L),(3)高糖+FoxO1上調(diào)組(HG+KI),(4)Bnip3 siRNA轉(zhuǎn)染組(HG+KI+Bnip3 siRNA)。各組處理后實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各組FoxO1、BNIP3、LC3、P62 mRNA的表達(dá)水平。Western blot檢測FoxO1表達(dá)水平及磷酸化狀態(tài)(p-FoxO1)、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平;免疫熒光化學(xué)檢測各組細(xì)胞FoxO1和BNIP3的表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測各組ROS的生成率;檢測各組細(xì)胞ATP的生產(chǎn)率。。結(jié)果:1.小鼠各組腎臟腎小管上皮細(xì)胞中FoxO1的表達(dá)以及活性的改變,與NG組相比,DM組小鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞中FoxO1蛋白水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),p-FoxO1/FoxO1蛋白水平增高(P0.05),與DM組相比,TG-DM組FoxO1蛋白水平增高(P0.05),p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05)。表示高糖可以誘導(dǎo)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性下降,轉(zhuǎn)基因小鼠FoxO1上調(diào)成功。2.動(dòng)物驗(yàn)證FoxO1對BNIP3通路的影響,與NG組相比,DM組BNIP3蛋白水平降低,LC3、P62蛋白水平均明顯升高(P0.05),與DM組相比,TG-DM組BNIP3蛋白水平升高,LC3、P62蛋白水平均降低(P0.05)。HE和掃描電鏡染色顯示TG-DM組腎小管結(jié)構(gòu)等病變均較DM組有所減輕。3.細(xì)胞各組FoxO1表達(dá)以及活性的改變:與NG組相比,HG組FoxO1 mRNA及蛋白水平無明顯變化,p-FoxO1/FoxO1水平增高(P0.05)。HG+KI組較HG組FoxO1 mRNA及蛋白水平升高,p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05)。說明高糖可以誘導(dǎo)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性下降,CRISPR/Cas9技術(shù)在腎小管上皮細(xì)胞過表達(dá)FoxO1成功。4.細(xì)胞中FoxO1對BNIP3通路的影響:與NG組相比,HG組BNIP3 mRNA及蛋白水平降低,LC3、P62 mRNA及蛋白水平均升高(P0.05),與HG組相比,HG+KI組BNIP3 mRNA及蛋白水平升高,LC3、P62 mRNA及蛋白水平均有所降低(P0.05)。轉(zhuǎn)染BNIP3敲除的質(zhì)粒后,上調(diào)FoxO1對上述指標(biāo)的影響被阻斷。5.與NG組相比,HG組明顯升高腎小管上皮細(xì)胞中ROS水平(P0.05),與HG組相比,HG+KI組可顯著抑制高糖的影響(P0.05),轉(zhuǎn)染BNIP3敲除的質(zhì)粒后,上調(diào)FoxO1對上述指標(biāo)的影響被阻斷。結(jié)論:(1)高糖能夠降低腎小管上皮細(xì)胞中FOXO1表達(dá)活性,導(dǎo)致線粒體功能障礙,引起細(xì)胞內(nèi)ROS的增加。(2)過表達(dá)FoxO1可以明顯提高高糖狀態(tài)下HK-2細(xì)胞線粒體自噬水平,降低高糖誘導(dǎo)的線粒體損傷,其機(jī)制可能是通過上調(diào)BNIP3實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：
圖 1 各組 HK-2 細(xì)胞 FoxO1 及 p-FoxO1 表達(dá)A：FoxOl mRNA 相對表達(dá)量；B：Western blot 檢測 FoxO1 及 p-FoxO1 水平；C: FoxO1 蛋白相對表達(dá)水平； D: p-FoxO1/FoxO1 的比值。*表示與 NG 組相比，P<0.05； #表示與 HG 組相比，P<0.05
免疫熒光化學(xué)檢測各組細(xì)胞FoxO1表達(dá)*表示與NG組相比，P<0.05；#表示與HG組相比，P<0.05
圖 3 各組 HK-2 細(xì)胞 BNIP3、P62 和 LC3 mRNA 相對表達(dá)量A：BNIP3 mRNA 表達(dá)；B：P62 mRNA 表達(dá)；C：LC3 mRNA 表達(dá)*表示與 NG 組相比，P<0.05； #表示與 HG 組相比，P<0.05；&表示與 HG+KI 組相比，P<0.05
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