【摘要】：骨質(zhì)疏松表現(xiàn)為較低的骨密度,是一種容易導(dǎo)致骨折的全身性骨骼疾病,嚴重影響公眾健康,與骨骼發(fā)育有密切關(guān)系。本研究室早期通過基因差異表達譜分析和基因組關(guān)聯(lián)分析等,發(fā)現(xiàn)STAT1基因與骨質(zhì)疏松密切相關(guān),但不清楚STAT1基因在體調(diào)控骨骼發(fā)育而導(dǎo)致骨表型改變的作用機制,所以本研究結(jié)合分子遺傳學(xué)手段,選擇斑馬魚模型進行在體研究,進一步揭示骨骼發(fā)育的分子調(diào)控機制,對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防、診斷、治療以及藥物開發(fā)都有重要意義。斑馬魚與人類在骨骼發(fā)育過程中的基因、信號通路有高度同源性,且STAT1基因進化上較為保守,人類STAT1基因的兩個不同剪接體STAT1-alpha和STAT1-beta對應(yīng)于斑馬魚兩個不同基因stat1a和stat1b,研究發(fā)現(xiàn)stat1a在斑馬魚胚胎早期表達量特別高。而且,與其他動物模型相比,斑馬魚個體小、幼魚通體透明,利于骨骼發(fā)育的觀察。本文主要通過CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù),在斑馬魚stat1a基因上設(shè)計合適的打靶位點,將體外合成的特異性sgRNA(終濃度20ng/μL)和Cas9-mRNA(終濃度300 ng/μL)顯微共注射進斑馬魚一細胞內(nèi),并通過活性檢測證實了所選位點的有效性。對F0代斑馬魚提取基因組DNA后進行T7E1酶切檢測以及Sanger測序,成功篩選到2條stat1a基因突變的F0代斑馬魚。在F1代受精后20天、30天和47天,隨機挑取兩個突變體的F1代斑馬魚和野生型斑馬魚各10條,測量其長度,發(fā)現(xiàn)突變體F1代斑馬魚要比野生型生長速度更快。結(jié)果與小鼠stat1-/-敲除研究發(fā)現(xiàn)骨密度與骨量增加一致,提示stat1可能通過抑制成骨細胞生成影響骨骼發(fā)育。目前,已經(jīng)從F2代胚胎中鑒定到stat1a突變體純合子。用Phyre軟件預(yù)測F1代突變體STAT1蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),其二級結(jié)構(gòu)的某些保守結(jié)構(gòu)域位點發(fā)生改變。STAT1蛋白的V638和S639處是同源二聚體界面,對應(yīng)于F1代突變體的這兩個氨基酸位點,V630和S631卻不再是同源二聚體接觸面。可能是由于stat1a基因突變影響STAT1同源二聚體的結(jié)合,影響骨骼的生長發(fā)育,從而導(dǎo)致斑馬魚生長更快。為進一步分析stat1a基因敲除后的變化,利用不同濃度STAT1抑制劑磷酸氟達拉濱(Fludarabine)處理斑馬魚胚胎10天,發(fā)現(xiàn)隨濃度增加死亡率也隨之增加。低于5μg/mL濃度組的死亡率低于10%,10μg/mL、20μg/mL以及40μg/mL濃度組死亡率達到30%-40%,而50μg/mL濃度組從處理第5天開始,死亡率接近70%。從處理第3天開始,實驗組斑馬魚陸續(xù)出現(xiàn)輕微或嚴重畸形,且隨處理濃度增大,畸形魚的死亡率增加,且死亡的斑馬魚絕大部分是畸形魚。氟達拉濱可抑制STAT1表達,而STAT1抑制成骨細胞分化,出現(xiàn)畸形可能是由于STAT1的抑制引起破骨細胞、成骨細胞生理功能失衡而導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常,最終產(chǎn)生骨表型的改變。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R580;Q344
【圖文】：

1.1.3.2 斑馬魚 stat1a、stat1b 基因與人類 STAT1 基因的同源性從GeneBank檢索表明斑馬魚stat1有兩個基因分別為stat1a與stat1b，與人類STAT1基因有很高的同源性，下圖1-1表示該基因及其編碼的蛋白與人類STAT1基因的相似性和差異[36]。與人類STAT1基因外顯子相比，斑馬魚stat1a、stat1b基因具有很高同源性，只缺少第一個不參與翻譯的外顯子。人類STAT1-alpha和斑馬魚Stat1a有五個相同的保守結(jié)構(gòu)域，包括N端的STAT二聚體作用穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域（STAT_int）、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（STAT_alpha）、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD或STAT_bind）、磷酸酪氨酸結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)域（SH2）以及C端反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD或STAT_TAZ2bind），而STAT1-beta與Stat1b缺少TAD結(jié)構(gòu)域。斑馬魚和人STAT1基因編碼的蛋白質(zhì)的SH2域高度保守，相似性達82 %，DNA結(jié)構(gòu)域相似性有73 %[37]。除了這幾個結(jié)構(gòu)域相似，斑馬魚Stat1a和Stat1b蛋白也保有某些STAT1功能必需的氨基酸殘基。人類STAT1蛋白中

6圖 1-2 STAT1 蛋白的氨基酸比對注：Rattus：大鼠，Mus：小鼠，Bos：家牛，Bubalus：水牛，Ovis：綿羊，Capra：山羊，Sus：野豬，Homo：人類，Xenopus：非洲爪蟾蜍。保守氨基酸殘基已標亮突出。引自文獻 DOI 10.1007/s11250-014-0682-6[38].1.1.3.4 斑馬魚 stat1a、stat1b 基因與人類 STAT1 基因功能相似性功能相似性主要表現(xiàn)在斑馬魚等硬骨魚類干擾素通路也是通過stat1介導(dǎo)的[40]。早有研究闡明了 stat1 功能的保守性，人的細胞株中 STAT1 基因缺失后可以用過量表達斑馬魚 stat1a 基因恢復(fù)正常的 IFN 信號[41]。因此，對斑馬魚 stat1 作用機制的

本實驗中所用斑馬魚均為野生型 AB 品系，來自中國科學(xué)院水生生物研究養(yǎng)殖基地，由項目研究主持單位湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究授提供。按照斑馬魚適宜生活條件，在斑馬魚房中進行飼養(yǎng)、繁殖與培育馬魚均在自動水循環(huán)系統(tǒng)中飼養(yǎng)，將溫度穩(wěn)定在 28.5 ± 0.5 ℃，每日固定 14 h。.2 CRISPR/Cas9 基因敲除靶位點設(shè)計在 National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查詢斑馬魚的基因組 DNA 序列及其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù) CRISPR/Cas 敲除原理，在網(wǎng)T Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9) 上設(shè)計一對stat1a基因的靶的選擇必須遵循此標準：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中 5’ 端的 GG 二核苷動子的一部分，設(shè)計靶位點時可以不受此限制，但是必須保證靶位點的GG。靶點的選擇必須確保靶點位置堿基的插入或者缺失可以影響 stat1個結(jié)構(gòu)域，從而改變基因的表達。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 蔣偉;黎滿香;田世成;顏運秋;;CRISPR系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能研究進展[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2012年10期

本文編號：2791177