【摘要】：糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種由多種病因引起的以血糖增高為特點的慢性代謝紊亂性疾病。是由胰島素分泌和作用缺陷引起的。其中多為2型糖尿病(T2DM),占糖尿病患者的90%以上。糖尿病可以發(fā)生在任何人的任何人生階段。隨著社會經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展,人類生活水平的不斷提高,人們的飲食結(jié)構(gòu)與生活習(xí)慣的改變,肥胖率上升,同時伴隨著人口的老齡化,糖尿病的發(fā)病率呈逐年快速增長的趨勢。據(jù)統(tǒng)計在過去的十年間,全球糖尿病患病率增長超過50%,2017年全球糖尿病患者已逾4.22億,嚴(yán)重威脅著人類的生命與健康。而在我國,成年人糖尿病患病率也高達(dá)10.9%,且有約15.5%的人群處于糖尿病前驅(qū)階段。因此,尋找糖尿病的危險因素,并且及早的進(jìn)行干預(yù)與預(yù)防已成為我國的重大公共安全問題。有研究表明糖尿病的發(fā)生與發(fā)展和飲食習(xí)慣有著極其密切的關(guān)系,不健康的飲食,例如高脂飲食,被認(rèn)為是發(fā)生糖尿病、肥胖等疾病的主要危險因素。以飽和脂肪酸為代表的脂肪攝入過量,被證實與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。2型糖尿病大部分患者以胰島素抵抗為主,病人多肥胖。近年來的研究表明,在嚙齒動物和人類中都觀察到了胰島β細(xì)胞群對肥胖的適應(yīng)性,有尸檢顯示,其在肥胖患者體內(nèi)增殖高達(dá)50%。在高脂飲食條件下,β細(xì)胞的增殖代表了細(xì)胞的自然適應(yīng)過程,長期高脂飲食后的代償性β細(xì)胞增殖被認(rèn)為是繼發(fā)于由肝原性系統(tǒng)因素所引起的胰島素抵抗。然而,最近的研究已經(jīng)揭示,在小鼠開始高脂喂養(yǎng)的幾天后,即開始出現(xiàn)了β細(xì)胞增殖,不論是否出現(xiàn)胰島素抵抗,這一現(xiàn)象暗示了潛在的替代機制。巨噬細(xì)胞(Macrophages,M?)屬于免疫細(xì)胞,來源于血液中的單核細(xì)胞,通過骨髓釋放入血液的單核細(xì)胞,在血液中經(jīng)過3~4天,進(jìn)入組織以及漿膜腔,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞。在生理狀態(tài)下,器官組織中存在少量的巨噬細(xì)胞,發(fā)揮特異性與非特異性免疫作用。近年來人們對于巨噬細(xì)胞的研究表明,巨噬細(xì)胞是一類具有可塑性和多功能性的細(xì)胞,在體內(nèi)外微環(huán)境的影響下,表現(xiàn)出明顯的功能差異。同時還有研究表明胰島內(nèi)的固有巨噬細(xì)胞能夠分泌各種因子參與胰島發(fā)育和組織重塑過程。目前,可根據(jù)巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)及其所發(fā)揮的功能不同,將巨噬細(xì)胞主要分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞即M1型(Classicallyactivated Macrophage)和替代性活化的巨噬細(xì)胞即M2型(Alternativelyactivated Macrophage)。在免疫炎癥反應(yīng)中,促炎的M1型巨噬細(xì)胞與抑制炎癥反應(yīng)的M2型巨噬細(xì)胞處于一種抗炎和促炎的平衡狀態(tài)。在許多慢性炎癥疾病中,例如糖尿病、動脈粥樣硬化等,這種平衡被打破,巨噬細(xì)胞將持續(xù)浸潤、活化并可能使抑制炎癥的機制受到破壞,使得病情進(jìn)一步發(fā)展。已經(jīng)有各種報告描述了2型糖尿病(T2D)和非肥胖的嚙齒類動物T2D模型中胰腺和胰島炎癥的增加。非糖尿病性非典型靈長類動物(NHPS)在長期高脂飲食所引起的胰島素抵抗的早期階段(12)個月也顯示了在胰腺組織中胰島相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加并伴隨著相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的增加。這些發(fā)現(xiàn)提示局部炎癥在代謝性疾病胰島功能損害中的作用。人類的胰島細(xì)胞按其染色和形態(tài)學(xué)特點,主要分為胰島α細(xì)胞、β細(xì)胞、delta細(xì)胞及PP細(xì)胞。其中α細(xì)胞約占胰島細(xì)胞的20%。當(dāng)血糖降低時,胰島α細(xì)胞可分泌胰高血糖素,以升高血糖;當(dāng)血糖升高時,則分泌減少,與β細(xì)胞分泌的胰島素共同作用,維持體內(nèi)血糖平穩(wěn)。在早期糖尿病病理生理機制的探索過程中,人們常常將關(guān)注點放在分泌胰島素的胰島β細(xì)胞上,而忽視了分泌胰高血糖素的胰島α細(xì)胞。我們假設(shè)短期高脂飲食可以誘導(dǎo)胰島巨噬細(xì)胞浸潤,并且巨噬細(xì)胞可調(diào)節(jié)β細(xì)胞復(fù)制增殖。為了驗證這些假設(shè)并分析高脂飲食誘導(dǎo)的β細(xì)胞復(fù)制的機制,我們利用成年C57BL/6J小鼠在給予或不給予含氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(一種巨噬細(xì)胞耗竭劑)的情況下被喂食高脂飲食7天,建立了短期高脂飲食模型,分別測定建模前與建模完成之后的小鼠體重,測定成模后附睪脂肪墊重量,檢測對比非空腹血糖,利用Elisa技術(shù)測定空腹血清胰島素水平,并利用免疫熒光病理技術(shù)檢測胰島細(xì)胞復(fù)制、氧化應(yīng)激和巨噬細(xì)胞的浸潤情況。探討短期高脂飲食與巨噬細(xì)胞浸潤,胰島β細(xì)胞的復(fù)制增殖的關(guān)系及其與胰島素抵抗的相關(guān)性,進(jìn)而闡明高脂飲食下的胰島β細(xì)胞的復(fù)制增殖是可動態(tài)調(diào)節(jié)的,分析高脂飲食所誘導(dǎo)的胰島微觀及宏觀環(huán)境的變化中,炎癥反應(yīng)在β細(xì)胞復(fù)制中的潛在作用,也有助于提高我們對于肥胖和2型糖尿病患者的功能性β細(xì)胞的保護能力。實驗結(jié)果如下:1.短期高脂飲食(7天)后,與對照組相比,高脂飲食實驗組小鼠胰島內(nèi)出現(xiàn)明顯巨噬細(xì)胞浸潤及β細(xì)胞復(fù)制。2.在給予高脂飲食的同時給予氯膦酸二鈉脂質(zhì)體-巨噬細(xì)胞清除劑的小鼠,胰島內(nèi)巨噬細(xì)胞與正常飲食組相比未見明顯增加,同時β細(xì)胞復(fù)制較未使用巨噬細(xì)胞耗竭劑的高脂飲食組小鼠相比明顯下降,與對照組差異不明顯。3.與對照組相比,小鼠空腹血清胰島素水平在單純高脂飲食組與高脂飲食同時給予巨噬細(xì)胞清除劑組明顯升高,說明小鼠胰島素敏感性下降,高脂飲食同時給予吡格列酮-胰島素增敏劑組,小鼠空腹血清胰島素水平略升高,但與對照組相比無明顯差異。4.短期高脂飲食后,小鼠的體重,附睪脂肪墊重量以及血糖水平較實驗前明顯升高。高脂飲食同時給予吡格列酮組小鼠的體重以及血糖水平都未見明顯升高,高脂飲食同時給予氯膦酸二鈉脂質(zhì)體組的小鼠血糖水平明也有明顯的增高,但體重較造模前未見明顯變化。5.對照組與高脂飲食組的8-oxo-2’-deoxyguanosine和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(activated caspase-3)染色未見明顯差異,說明短期高脂飲食并沒有顯著的誘導(dǎo)DNA損傷或者細(xì)胞凋亡。6.基質(zhì)細(xì)胞生成因子(Stromal cell-Derived Factor,SDF)-1在高脂飲食組小鼠胰腺組織的表達(dá)情況與正常飲食組小鼠相比,其差異并不明顯。7.高脂飲食組發(fā)生巨噬細(xì)胞浸潤后,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)陽性的巨噬細(xì)胞,即M1型巨噬細(xì)胞所占比例明顯增加。結(jié)合以上實驗結(jié)果,我們可以得出結(jié)論,短期高脂飲食可促進(jìn)機體及附睪脂肪墊重量和血糖水平的增加,同時也可升高空腹血清胰島素濃度。喂食高脂飲食的小鼠胰島β細(xì)胞復(fù)制、胰島巨噬細(xì)胞浸潤顯著增加,且iNos陽性的巨噬細(xì)胞百分比也有明顯升高。同時,短期高脂飲食對DNA損傷及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用并不顯著。雖然通過巨噬細(xì)胞清除劑的治療,巨噬細(xì)胞被清除進(jìn)而消除了高脂飲食對一道β細(xì)胞復(fù)制的誘導(dǎo)作用,但不論是否使用巨噬細(xì)胞清除劑,高脂飲食后都有明顯非空腹血糖和空腹血清胰島素的水平的持續(xù)升高。這些結(jié)果表明,高脂飲食誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤是導(dǎo)致β細(xì)胞復(fù)制的誘因,且其誘導(dǎo)的β細(xì)胞復(fù)制的機制與胰島素抵抗無關(guān)。另外我們利用細(xì)胞分選技術(shù)分選人胰島細(xì)胞,分別獲得純度高于95%的β細(xì)胞群與α細(xì)胞群,并將其在37度孵育箱中培養(yǎng)3天后,測定α細(xì)胞在存在與不存在β細(xì)胞及胰島素時,對不同葡萄糖濃度的應(yīng)答情況,以探究β細(xì)胞對α細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)作用。其結(jié)果如下:1.當(dāng)葡萄糖濃度較低時(2mM),單純α細(xì)胞群、α與β混合細(xì)胞群都可分泌較高的胰高血糖素,兩者之間差異不明顯。2.當(dāng)葡萄糖濃度較高時(16.8mM),其對α與β混合細(xì)胞群胰高血糖素釋放的抑制作用要明顯高于單純α細(xì)胞群。3.高葡萄糖濃度并加入胰島素后,其對單純α細(xì)胞群釋放胰高血糖素的抑制作用明顯增強。通過以上研究,我們確立了人胰島α細(xì)胞的體外研究模型,為α細(xì)胞的進(jìn)一步研究提供了一定的基礎(chǔ)與新思路。同時我們通過加入β細(xì)胞和胰島素到α細(xì)胞群,測定其對葡萄糖濃度的應(yīng)答情況,再次確定了β細(xì)胞對α細(xì)胞釋放胰高血糖素的調(diào)節(jié)情況,為下一步對其相關(guān)機制的研究提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文胞，進(jìn)行免疫熒光染色，查看 F4/80 陽性細(xì)胞的表達(dá)情況，比較對照組與各實驗組之間的巨噬細(xì)胞浸潤情況的差異。在短期高脂飲食 7 天后，與正常飲食對照組相比，單純高脂飲食組小鼠胰島靶向性巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，其巨噬細(xì)胞與胰島 β 細(xì)胞的百分比為 10.74±0.95%，而正常飲食對照組的百分比為 5.32±0.94%(圖 4.4, A、B、E)。而由于胰腺外分泌組織中未見明顯巨噬細(xì)胞浸潤，所以我們認(rèn)為短期高脂飲食誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤是胰島靶向性的。而短期高脂飲食伴巨噬細(xì)胞清除劑組的小鼠，其胰島內(nèi)未見巨噬細(xì)胞增多(圖 4.4,C、E)，說明藥物起效明顯，起到清除巨噬細(xì)胞的作用。另外，短期高脂飲食伴吡格列酮(胰島素增敏劑)組的小鼠胰島內(nèi)也未見明顯巨噬細(xì)胞浸潤(圖 4.4,D、E)，可能與吡格列酮對巨噬細(xì)胞的直接抑制作用有關(guān)[80,81]。

圖 4.4 E 巨噬細(xì)胞在胰島內(nèi)的平均百分比每組實驗動物 5 只。與對照組相比，單純高脂飲食組的小鼠胰島內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯增多，*P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其他兩組與對照組相比，無明顯差異。Normal Chow: 正常飲食 組 ， HFD: 高 脂 飲 食 組 ， HFD+Clodronate: 高 脂 飲 食 伴 巨 噬 細(xì) 胞 清 除 劑 組 ，HFD+Pioglitazone：高脂飲食伴吡格列酮組。4.2.2 浸潤巨噬細(xì)胞多為 M1 型巨噬細(xì)胞我們知道巨噬細(xì)胞具有極強的可塑性，以響應(yīng)各種環(huán)境刺激，這就允許他們具有特異性和顯示極化的功能特性，如炎癥或抗炎作用。因此，雖然通過上述實驗結(jié)果，我們已可以確定在高脂飲食早期，已經(jīng)存在巨噬細(xì)胞浸潤小鼠胰島的情況，但是，并不能確定其表型，為進(jìn)一步研究小鼠胰島內(nèi)浸潤巨噬細(xì)胞的種類，進(jìn)而更好的理解其在高脂飲食早期在小鼠胰島內(nèi)的作用(例如誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞復(fù)制)，我們首先檢測了實驗結(jié)束后收集的小鼠胰腺組織所做冰凍切片上M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物 iNOS 在 F4/80 陽性細(xì)胞上的表達(dá)。如圖 4.5 所示，正常

圖 4.5 巨噬細(xì)胞、iNOS 及 β 細(xì)胞免疫熒光染食組小鼠胰腺組織切片染色。 E-H：單純高脂飲食用抗胰島素抗體(紫色)進(jìn)行免疫染色。B 和 F：巨噬化染色。C 和 G：iNOS 用抗 iNOS 抗體(綠色)和 F4／和 H：iNOS 和胰島素染色的疊加。細(xì)胞核染色為藍(lán)色看到兩個巨噬細(xì)胞，其中一個為 iNOS 陽性，另一個為處可以看到一個 iNOS 陽性巨噬細(xì)胞。

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本文編號：2790673