【摘要】：目的:觀察耐受性樹突狀細胞(dendritic cells,DC)在輸入膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠體內(nèi)后能否形成微嵌合狀態(tài),探討耐受性DC對CIA大鼠治療干預(yù)的內(nèi)在機制。方法:以CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠為實驗動物。1.核因子-κB(Nuclearfactor-kappa B,NF-κB)寡核苷酸誘騙策略(oligodeoxynucleotidedecoy,ODNDecoy)誘導 CIA 雌性 SD 大鼠和正常雄性SD大鼠來源耐受性DC的構(gòu)建:(1)正常雌性SD大鼠左足跖部皮內(nèi)注射200μl牛二型膠原(BIIC)乳劑進行CIA模型制備;(2)取CIA雌性SD大鼠(初次免疫后第13天)和正常雄性SD大鼠脾臟單個核細胞,用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素-4(IL-4)培養(yǎng)為DC,經(jīng)NF-κB ODN Decoy誘導為耐受性DC:(3)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源的培養(yǎng)細胞各分為4組;(4)DC生物學性狀觀察:倒置顯微鏡、吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)特征,臺盼藍染色計數(shù)活細胞率,流式細胞術(shù)檢測大鼠DC特異性標志OX-62鑒定純度,檢測DC表面CD80、CD86分子表達情況和同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)評估耐受性DC的耐受性及其穩(wěn)定程度。2.CIA大鼠體內(nèi)輸入耐受性DC微嵌合狀態(tài)的觀察:(1)制備CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源的耐受性DC,并負載BIIC,記為BIIC-Decoy DC,用DiR熒光染料標記,記為BIIC-DecoyDC(?);(2)臺盼藍染色評估細胞標記DiR熒光染料前后活細胞率,MTT實驗評價BIIC-Decoy DC(?)對細胞活性的影響;(3)活體成像系統(tǒng)(In Vivo Imaging System,IVIS)觀察BIIC-Decoy DC(?)熒光強度;(4)IVIS活體成像實驗分組:A組:同種異體正常雄性SD大鼠來源BIIC-Decoy DC(?),于病程第5天,尾靜脈輸入CIA大鼠(即病程早期CIA)體內(nèi);B組:同種異體正常雄性SD大鼠來源BIIC-Decoy DC(?),于病程第20天,尾靜脈輸入CIA大鼠(即病程中期CIA)體內(nèi);C組:CIA大鼠自體來源BIIC-Decoy DC(?)尾靜脈輸入病程中期CIA大鼠體內(nèi)。正常雌鼠對照(normal female control,NFc)組:同種異體正常雄性SD大鼠來源BIIC-Decoy DC(?)尾靜脈輸入正常雌性SD大鼠體內(nèi);正常雄鼠對照(normal male control,NMc)組:正常雄性SD大鼠自體來源BIIC-Decoy DC(?)尾靜脈輸入正常雄性SD大鼠體內(nèi)。非標記細胞對照(cell control):用無熒光標記的BIIC-Decoy DC代替標記細胞,作為A、B、C組的非標記細胞對照,記為Acc、Bcc、Ccc組。模型空白對照(model control):用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)代替標記細胞,作為A、B、C組的模型空白對照,記為Amc、Bmc、Cmc組。(5)IVIS活體成像:將上述兩種來源BIIC-Decoy DC(?)經(jīng)尾靜脈輸入各組大鼠體內(nèi)后4h、24h、5day、10day、20day、25day等時間點,動態(tài)觀察細胞進入大鼠體內(nèi)后的遷移、分布及微嵌合狀態(tài);(6)活體成像結(jié)束后檢測指標:取離體臟器進行IVIS成像;取血清檢測IL-2和IFN-y;IL-4和IL-10等細胞因子水平;取踝關(guān)節(jié)作病理切片。結(jié)果:(1)耐受性DC的構(gòu)建:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源脾臟單個核細胞成功誘導為耐受性DC,其活細胞率均94%,細胞純度均85%;DC表面CD80、CD86分子表達情況和同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)結(jié)果顯示其耐受性具有較好的穩(wěn)定程度;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源的耐受性DC負載BIIC,成功構(gòu)建BIIC-Decoy DC,標記DiR熒光染料,記為BIIC-Decoy DC(?);(3)臺盼藍染色:DiR熒光染料標記前后BIIC-Decoy DC活細胞率均在95%左右;(4)MTT實驗:結(jié)果顯示DiR熒光染料標記上述兩種來源BIIC-Decoy DC后,對其細胞活性無影響;(5)IVIS成像檢測結(jié)果顯示DiR熒光染料成功標記上BIIC-Decoy DC,且熒光強度隨細胞數(shù)量增加而增強;(6)IVIS活體成像結(jié)果:熒光信號主要集中在胸腹部,隨成像時間延長可向其他部位遷移,如四肢關(guān)節(jié);熒光強度隨成像時間延長而逐漸降低;熒光信號多以24h達高峰,最長觀察至第35天,仍可見熒光信號;(7)離體器官IVIS成像結(jié)果:熒光信號主要集中在肺臟、脾臟和淋巴結(jié)中,以肺臟熒光信號最強,肝臟、心臟和腎臟熒光信號相對較弱;(8)血清細胞因子水平檢測:在病程早期和病程中期CIA大鼠模型組中,IFN-γ、IL-2等Th1型細胞因子表達水平較高,IL-10、IL-4等Th2型細胞因子較低;而在病程早期和病程中期CIA大鼠治療組中,IFN-γ、IL-2等Th1型細胞因子表達明顯降低,IL-10、IL-4等Th2型細胞因子表達明顯升高;(9)踝關(guān)節(jié)病理結(jié)果:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源BIIC-Decoy DC對病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均顯示出良好的治療效果。結(jié)論:(1)改良DC提取方法,獲得CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源耐受性DC純度均85%;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源BIIC-Decoy DC對病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均具有較好的治療效果;(3)利用IVIS成像系統(tǒng)動態(tài)觀察DiR熒光染料標記CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來源BIIC-Decoy DC經(jīng)尾靜脈輸入CIA大鼠體內(nèi)后,廣泛分布于肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織,持續(xù)至第35天仍可檢測到熒光信號,初步判斷微嵌合狀態(tài)形成。血清細胞因子水平檢測結(jié)果顯示微嵌合狀態(tài)形成的同時,體內(nèi)細胞因子格局由Th1向Th2方向偏移,有利于免疫耐受的形成。
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R593.22
【圖文】：

８天）（集落）；Ｅ表示ＣＩＡ雌性大鼠來源ｃｏｎｔｒｏｌ邋（第８天）（樹突狀突起）；Ｆ表示Ｃ１Ａ大逡逑鼠來源邋ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ。逡逑圖２－丨（’丨Ａ雌性大鼠來源丨）（’倒置顯微鏡結(jié)果（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ（２０（）ｘ）逡逑ｃ？邋ｍｉ逡逑Ａ邐Ｒ邋—逡逑注：Ａ表示Ｃｏｎｔｒｏｌ組ＤＣ；邋Ｂ表示Ｄｅｃｏｙ組ＤＣ。逡逑圖２－２邋ＣＩＡ雌性大鼠ＤＣ吉姆薩染色結(jié)果（１０（）ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ邋（邋１邋（）0ｘ邋）逡逑２．２邋ＣＩＡ雌性ＳＤ大鼠和正常雄性ＳＤ大鼠來源ＤＣ細胞活性檢測逡逑２．２．１臺盼藍染色檢測活細胞率逡逑圖八，Ｂ為剛提取出的單個核細胞，圖Ｃ，Ｄ為培養(yǎng)至第８天的ＤＣ，重復(fù)實驗逡逑臺盼藍染色結(jié)果顯示活細胞率均在９４％左右（見圖２－３Ａ－Ｄ）。圖Ｅ，Ｆ為ＤｉＲ熒逡逑光染料標記前，Ｇ，Ｈ為ＤｉＲ熒光染料標記后，標記前后臺盼藍染色結(jié)果顯示活逡逑細胞率均在９５％左右（見圖Ｅ－Ｈ）。逡逑本文受國家白然科學？金地區(qū)科學

８天）（集落）；Ｅ表示ＣＩＡ雌性大鼠來源ｃｏｎｔｒｏｌ邋（第８天）（樹突狀突起）；Ｆ表示Ｃ１Ａ大逡逑鼠來源邋ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ。逡逑圖２－丨（’丨Ａ雌性大鼠來源丨）（’倒置顯微鏡結(jié)果（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ（２０（）ｘ）逡逑ｃ？邋ｍｉ逡逑Ａ邐Ｒ邋—逡逑注：Ａ表示Ｃｏｎｔｒｏｌ組ＤＣ；邋Ｂ表示Ｄｅｃｏｙ組ＤＣ。逡逑圖２－２邋ＣＩＡ雌性大鼠ＤＣ吉姆薩染色結(jié)果（１０（）ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ邋（邋１邋（）0ｘ邋）逡逑２．２邋ＣＩＡ雌性ＳＤ大鼠和正常雄性ＳＤ大鼠來源ＤＣ細胞活性檢測逡逑２．２．１臺盼藍染色檢測活細胞率逡逑圖八，Ｂ為剛提取出的單個核細胞，圖Ｃ，Ｄ為培養(yǎng)至第８天的ＤＣ，重復(fù)實驗逡逑臺盼藍染色結(jié)果顯示活細胞率均在９４％左右（見圖２－３Ａ－Ｄ）。圖Ｅ，Ｆ為ＤｉＲ熒逡逑光染料標記前，Ｇ，Ｈ為ＤｉＲ熒光染料標記后，標記前后臺盼藍染色結(jié)果顯示活逡逑細胞率均在９５％左右（見圖Ｅ－Ｈ）。逡逑本文受國家白然科學？金地區(qū)科學

核細胞；Ｃ，Ｄ表示培養(yǎng)第８天ＤＣ；邋Ｅ，Ｆ為ＤｉＲ熒光染料標記前；Ｇ，Ｈ為ＤｉＲ熒光染料標記逡逑后。逡逑圖２－３邋ＤＣ臺盼藍染色觀察（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｉ＇ｈｃ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋（２０0ｘ）逡逑２．２．２邋ＭＴＴ檢測ＤｉＲ焚光染料標記ＣＩＡ雌性大鼠和正常雄性大鼠來源ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ逡逑ＤＣ后細胞活性結(jié)果逡逑（１）邋ＤｉＫ熒光染料標記ＣＩＡ雌性大鼠來源的ＢｌＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ活性檢測結(jié)果逡逑①

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