【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種累及多器官、多系統(tǒng),臨床表現(xiàn)復(fù)雜的自身免疫性疾病,其主要病理特征是患者血清中存在大量的IFN-a及自身抗體,尤其是抗dsDNA抗體。目前認(rèn)為其發(fā)病主要由多種因素相互作用,但是其確切的發(fā)病機(jī)制仍然不清。大量研究表明,B細(xì)胞作為抗體分泌細(xì)胞是SLE發(fā)病的直接參與者,并且SLE患者的B細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)。SLE患者血清中也存在大量的IFN-a,并且與疾病活動程度及抗dsDNA抗體的滴度顯著相關(guān),SLE患者體內(nèi)干擾素誘導(dǎo)基因顯著高表達(dá)。已報道IFN-a誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路異�；罨赟LE的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,IFN-a能夠通過激活JAK1-STATl通路顯著地調(diào)控B細(xì)胞的生存、活化、抗體分泌等功能。我們前期研究也發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血B細(xì)胞中干擾素誘導(dǎo)基因顯著高表達(dá),其JAK1-STAT1通路過度活化。值得注意的是,SLE發(fā)病具有明顯的性別傾向,男女發(fā)病比例為1：9,并且已有研究表明雌激素在SLE的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用�？墒�,迄今還不完全清楚：①IFN-α與雌激素是否能夠相互作用影響SLE患者的B細(xì)胞；②什么因素導(dǎo)致SLE患者B細(xì)胞中IFN-a激活的主要信號途徑JAK1-STAT1通路過度活化。因此,本論文從以下三個方面深入探索了調(diào)控B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路活化的因素及其具體作用機(jī)制,以便為人們更好的理解和探索SLE發(fā)病的機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。1.雌激素通過IKK-ε促進(jìn)B細(xì)胞中IFN-a誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路活化已有研究表明雌激素能夠促進(jìn)SLE的發(fā)��；IFN-α能夠促進(jìn)SLE的發(fā)生發(fā)展且SLE患者B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路過度活化。但是目前仍不清楚雌激素是否參與調(diào)控B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路的活化。我們首先利用基因芯片分析健康男女外周血CD19+B細(xì)胞中基因表達(dá)的差異。有趣的是,與健康男性相比,健康女性外周血B細(xì)胞中多種干擾素誘導(dǎo)基因顯著高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),與雄性C57BL/6小鼠相比,雌性C57BL/6小鼠脾臟B220+B細(xì)胞同樣高表達(dá)多種干擾素誘導(dǎo)基因。為了研究這種性別差異是否與雌激素有關(guān),我們對雌性C57BL/6小鼠做了卵巢切除手術(shù),并用主要的雌激素—雌二醇或安慰劑分別處理小鼠4周。結(jié)果顯示,與安慰劑處理的切卵巢小鼠相比,雌二醇處理的切卵巢小鼠脾臟B細(xì)胞中多種干擾素誘導(dǎo)基因明顯高表達(dá)。我們的體外研究發(fā)現(xiàn),雌激素不僅能夠促進(jìn)小鼠B細(xì)胞中IFN-α誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路的活化,而且能夠增強(qiáng)IFN-α對B細(xì)胞增殖、活化的促進(jìn)作用,其具體機(jī)制為：雌激素通過下調(diào)非編碼微小RNA.(microRNA) let-7e-5p、miR-98-5p 以及 miR-145a-5p(均能夠靶向IKK-ε的3'UTR區(qū))的表達(dá)促進(jìn)IKK-ε的表達(dá)；IKK-ε通過促進(jìn)STAT1的磷酸化促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路的活化。不僅如此,與雄性C57BL/6小鼠相比,雌性C57BL/6小鼠脾臟B細(xì)胞中l(wèi)et-7e-5p、miR-98-5p 以及 miR-145a-5p的表達(dá)顯著下調(diào),而IKK-ε的表達(dá)顯著上調(diào)。同時,我們還檢測了健康男女外周血PBMCs中l(wèi)et-7e-5p、miR-98-5p、miR-145a-5 p以及IKK-ε的表達(dá)。結(jié)果顯示,與健康成年男性相比,健康成年女性PBMCs中l(wèi)et-7e-5p、miR-98-5p以及miR-145a-5p的表達(dá)顯著下調(diào),而IKK-ε的表達(dá)顯著上調(diào)。以上研究結(jié)果表明,雌激素能夠通過上調(diào)IKK-ε促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路的活化進(jìn)而調(diào)控B細(xì)胞的活化,提示雌激素對B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路活化的促進(jìn)作用可能是SLE發(fā)病具有明顯性別傾向的機(jī)制之一。2. STS-1-c-cbl-Tyk2信號軸通過促進(jìn)JAK1-STAT1通路活化調(diào)控B細(xì)胞自噬SLE患者B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路過度活化；而JAK1-STAT1通路在IFN-I誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。最新研究表明,SLE患者及NZB/WF1狼瘡小鼠B細(xì)胞中自噬水平明顯升高,自噬能夠通過調(diào)控B細(xì)胞的分化、生存及抗體分泌等功能促進(jìn)SLE的發(fā)生發(fā)展。但是SLE患者B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路過度活化的具體機(jī)制仍不完全清楚,并且導(dǎo)致SLE患者B細(xì)胞中自噬水平增強(qiáng)的原因是什么呢?我們通過分析本實驗室前期的SLE患者外周血CD19+B細(xì)胞基因芯片從中篩選出一個在SLE’患者外周血B細(xì)胞中顯著高表達(dá)的基因STS-1。為了進(jìn)一步驗證STS-1是否在SLE患者以及MRL/lpr狼瘡小鼠中高表達(dá),我們磁珠分選了SLE患者外周血CD19+B細(xì)胞以及MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟B220+B細(xì)胞,并通過Q-PCR驗證SLE患者以及MRL/lpr小鼠的B細(xì)胞中STS-1的確顯著高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TLR7、TLR9以及BCR通路參與調(diào)控B細(xì)胞中STS-1的表達(dá)。接下來我們深入研究了STS-1對B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路活化的調(diào)控作用,令人驚奇的是STS-1能夠顯著促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路活化,其具體機(jī)制為：STS-1通過結(jié)合并抑制c-cbl的磷酸化促進(jìn)Tyk2的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)IFN-a誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路活化。此外,我們還發(fā)現(xiàn)STS-1能夠通過去磷酸化Syk抑制IFN-α誘導(dǎo)的PI3K-mTOR通路的活化。有趣的是,IFN-α能夠通過激活JAK1-STAT1通路誘導(dǎo)人外周血CD19+B細(xì)胞以及小鼠脾臟B220+B細(xì)胞發(fā)生自噬,而STS-1能夠顯著促進(jìn)Raji細(xì)胞中IFN-α誘導(dǎo)的自噬。最后我們發(fā)現(xiàn)MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟B220+B細(xì)胞中自噬水平的確顯著增強(qiáng)。以上研究結(jié)果表明,STS-1顯著促進(jìn)B細(xì)胞中IFN-a誘導(dǎo)的JAK1-STAT1通路活化及自噬發(fā)生,這就提示STS-1可能是治療SLE的新靶點(diǎn)。3. dsDNA直接激活B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路鑒于JAK1-STAT1通路在B細(xì)胞分化、抗體分泌以及自噬等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,那么除了IFN-α之外是否還存在其他因素能夠激活B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路呢?已有研究報道,SLE患者體內(nèi)含有大量的抗dsDNA自身抗體,而雙鏈DNA (double-stranded DNA, dsDNA)能夠誘導(dǎo)IFN-I的分泌從而間接激活JAK1-STAT1通路,并且干擾素刺激基因(STING)在dsDN A識別的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。但是目前還不完全清楚dsDNA是否能夠直接調(diào)控JAK1-ST AT1通路的活化以及STING在其中發(fā)揮什么作用。我們研究發(fā)現(xiàn)dsDNA通過磷酸化Lyn直接激活B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路。有趣的是,STING能夠促進(jìn)SHP-1/2的磷酸化進(jìn)而抑制dsDNA對JAK1-STAT1通路的激活作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)STING在SLE患者及MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟B細(xì)胞中顯著低表達(dá),dsDNA.TLR7和TLR9介導(dǎo)的信號通路能夠顯著抑制B細(xì)胞中STING的表達(dá)。以上研究表明,dsDNA能夠直接激活B細(xì)胞中JAK1-STAT1信號通路,而STING在其中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用；STING在SLE患者及MRL/lpr小鼠B細(xì)胞中低表達(dá)可能與JAK1-STAT1通路過度活化有關(guān)。綜上所述,我們首先利用基因芯片發(fā)現(xiàn)健康男女外周血B細(xì)胞中干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)存在顯著差異,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雌激素通過上調(diào)IKK-ε的表達(dá)促進(jìn)B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路的活化進(jìn)而調(diào)控B細(xì)胞的增殖、活化；其次,我們發(fā)現(xiàn)在STS-1在SLE患者外周血B細(xì)胞中顯著高表達(dá),并且其能夠結(jié)合并抑制c-cbl的磷酸化調(diào)控B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路的活化及自噬發(fā)生。有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)dsDNA通過磷酸化Lyn直接激活B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路。本論文從不同角度深入研究了調(diào)控SLE患者B細(xì)胞中JAK1-STAT1通路活化的因素及其具體作用機(jī)制,我們的研究結(jié)果不僅為人們深入理解和探索SLE的發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ),而且為SLE的臨床治療提供新的視角。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241
【圖文】：

Ｎ－ａ通過誘導(dǎo)ＢＡＦＦ的表達(dá)促進(jìn)Ｂ細(xì)胞的增殖、活化及抗ＢＡＦＦ在ＳＩ＾Ｅ患者體內(nèi)水平明顯升高［５２－５５］，ＢＡＦＦ轉(zhuǎn)基狀［５６－５８］，而且ａｎｔｉ－ＢＡＦＦ單抗能夠巧效緩解化Ｅ的病情，ＢＡＦＦ能夠促進(jìn)生發(fā)中必形成、Ｂ納胞化存及抗體轉(zhuǎn)換［ＩＦＮ－ａ能夠調(diào)控ＤＣｓ和巨晦細(xì)胞產(chǎn)生ＢＡＦＦ邋［４９－５１］。由此ＢＡＦＦ的表達(dá)間接調(diào)控Ｂ細(xì)胞的生存Ｗ及抗體轉(zhuǎn)換。逡逑Ｎ－ａ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，清理不徹底的細(xì)胞調(diào)亡碎片可作細(xì)胞或者激活其他抗原地呈細(xì)胞，運(yùn)些抗原遞呈細(xì)胞激毒性Ｔ細(xì)胞產(chǎn)生更多的細(xì)胞碎片或促進(jìn)Ｂ細(xì)胞分化，進(jìn)ＳＬＥ臨床癥狀［６４］。逡逑Ｎ－ａ能夠上調(diào)Ｂ細(xì)胞中ＴＬＲ７的表達(dá)。ＴＬＲ７高表達(dá)能夠促激活Ｂ細(xì)胞［６５］。研究發(fā)現(xiàn)，幼稚Ｂ細(xì)胞中ＴＬＲ７的表達(dá)

，。［１６０，１６１］，ｄｓＤＮＡ能夠激活免疫反應(yīng)，促進(jìn)自身反應(yīng)性抗體的產(chǎn)化進(jìn)郵促進(jìn)ＳＬＥ逡逑的發(fā)�。郏保叮玻保叮矗�。逡逑現(xiàn)有的研究表明，細(xì)胞識別ＤＮＡ主要依賴于ＴＬＲ９、民ＩＧ－Ｉ及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的逡逑ＤＮＡ感受器如ＡＩＭ２、ｃＧＡＳ、ＬＲＲＦＩＰ１和ＺＢＰ１等（如圖５所示）。最新研究發(fā)逡逑現(xiàn)一種新的蛋白，干擾素基因刺激因子（ＳＴＩＮＧ）在細(xì)胞識別來源于ＤＮＡ病原逡逑體、壞死或非正常死亡的胞質(zhì)ＤＮＡ的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［１６５－１６７］。胞逡逑質(zhì)ＤＮＡ通過激活ＳＴＩＮＧ－ＴＢＫ１－ＩＲＦ３信號通路促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，其中最逡逑重要的便是ＩＦＮ－Ｉ。己有許多研究發(fā)現(xiàn)ＳＴＩＮＧ及其相關(guān)的信號通路在許多炎癥義逡逑自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［１６５，１６８］。然而，Ｓｈａｒｍａ等人最新逡逑的研究表明敲除ＳＴＩＮＧ能夠促進(jìn)狼瘡小鼠發(fā)病，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲除ＳＴＩＮＧ的逡逑狼瘡小鼠中自身抗體明顯高于普通的狼瘡小鼠［１６９］。由此可見，ＳＴＩＮＧ在ＳＬＥ逡逑發(fā)病中的具體作用還不是很明確。逡逑邐…逡逑

接下來我們借助生物信息學(xué)分析，研究了這些差異表達(dá)基因的功能。我們逡逑首先采用基于Ｇｅｎｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ數(shù)據(jù)庫的ＧＯ分類法（基因本體論）對這些ＤＥＧｓ逡逑進(jìn)行基因功能分析。如圖１－２所示，這些差異表達(dá)的基因廣泛的參與多種生物學(xué)逡逑過程，比如細(xì)胞表面受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等。逡逑ＡＵ邋ＤＥＧｓ逡逑泌１逡逑乻邋ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ逡逑１１１邋１邋Ｊ邋１＝１１邋ＩＩ邋ｌｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑ｊ＇ｌ劶Ｉ懸！呡Ｉ呈Ｉ邋！§■邋Ｉ昔｜邋！■邋Ｉ逡逑量Ｉ灥呈ｅ邋ｓ逡逑Ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌｅｖａｎｔ邋ＤＥＧｓ逡逑－ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ逡逑ｙ邋Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐｝逡逑Ｗｌ＇ｌｉｌ邋Ｉ邋．１邋ｉｆ邋ｉｌ邋ｌｌ邋ｉｔ邋１ｉ逡逑３聲５與置芒己ｉ寶！邋吾虧ａ邋Ｉ邋Ｉ？直已含逡逑

本文編號：2783004