【摘要】：一、研究背景強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病。疾病特征包括起止點(diǎn)炎、漸進(jìn)發(fā)展的骶髂關(guān)節(jié)炎以及脊柱關(guān)節(jié)強(qiáng)直。該病好發(fā)于青壯年男性并且發(fā)病率較高,由于缺乏典型的早期癥狀和明確的早期生物標(biāo)記物,AS通常在第一次臨床癥狀出現(xiàn)后的8-10年時(shí)間才能得到明確的診斷。晚期患者脊柱的骨性強(qiáng)直及髖關(guān)節(jié)的骨性融合將導(dǎo)致患者完全喪失生活和工作的能力,對家庭和社會產(chǎn)生極大負(fù)擔(dān)。脊柱及關(guān)節(jié)部分的骨化作為AS主要病理特征,目前關(guān)于它的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制也尚不清楚。因此尋找AS的早期診斷標(biāo)志物以及探索骨化發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制一直是AS研究的熱點(diǎn)。自身抗體是多種自身免疫性疾病的免疫標(biāo)記物,可作為早期診斷,疾病活動(dòng)度的觀測,治療預(yù)后評估等的標(biāo)志物。由于缺乏類風(fēng)濕因子,強(qiáng)直性脊柱炎一直被認(rèn)為是血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病,血清抗體較少被考慮作為生物標(biāo)記物進(jìn)行研究。然而,近年來越來越多的證據(jù)表明B細(xì)胞和相應(yīng)的體液免疫反應(yīng)可能通過抗原提呈,抗體產(chǎn)生等方式參與AS的發(fā)病過程。因此,本課題試圖通過蛋白芯片在AS血液樣本中篩選到合適的可以作為AS早期診斷的標(biāo)志物,并研究自身抗體相應(yīng)的抗原蛋白在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制,從而為強(qiáng)直性脊柱炎尋找合適的標(biāo)志物及可能的治療靶點(diǎn)。二、研究目的第一部分:篩選強(qiáng)直性脊柱炎患者血漿內(nèi)的自身抗體并擴(kuò)大樣本驗(yàn)證Kaiso蛋白自身抗體在強(qiáng)直性脊柱炎血漿內(nèi)的表達(dá)情況。第二部分:探究Kaiso分子在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對成骨分化進(jìn)程的影響。第三部分:探索Kaiso分子調(diào)節(jié)成骨分化進(jìn)程的具體機(jī)制。三、研究方法第一部分:(1)HuProt蛋白芯片篩選強(qiáng)直性脊柱炎患者及正常人血漿:經(jīng)過芯片封閉,芯片雜交,芯片檢測,數(shù)據(jù)提取與分析等步驟篩選出強(qiáng)直性脊柱炎患者血漿內(nèi)特異性的自身抗體。(2)血漿自身抗體表達(dá)水平的驗(yàn)證:基于Meso Scale Discovery(MSD)技術(shù),利用夾心法,即將重組蛋白包被在板底,然后加入含有待測抗體的血漿樣本或陽性對照抗體進(jìn)行孵育,再加入帶有sulfo標(biāo)簽的抗待測抗體的二抗,最終利用電化學(xué)發(fā)光原理檢測,從而得出不同血漿樣本中的抗體表達(dá)水平。第二部分:(1)Kaiso分子過表達(dá)、敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立:通過病毒載體的構(gòu)建,慢病毒包裝,慢病毒感染細(xì)胞及嘌呤霉素篩選等實(shí)驗(yàn)步驟完成慢病毒感染穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建。熒光定量PCR及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過表達(dá)及敲減效率。(2)成骨分化的誘導(dǎo)及檢測:在培養(yǎng)基中添加50μg/ml抗壞血酸,10 mMβ-甘油磷酸鈉,50 ng/ml BMP2重組蛋白進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。在不同時(shí)間點(diǎn)使用PCR技術(shù)檢測骨化相關(guān)分子的變化、使用BCIP/NBT法進(jìn)行染色檢測堿性磷酸酶的表達(dá)情況、使用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒檢測堿性磷酸酶活性、使用茜素紅S染色法觀察鈣結(jié)節(jié)形成,從而評價(jià)不同細(xì)胞株成骨分化能力。(3)裸鼠體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn):將Kaiso過表達(dá)、敲減及相應(yīng)對照的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞株接種到β-TCP材料支架上,細(xì)胞-材料復(fù)合物植入裸鼠肌肉內(nèi)部模擬活體環(huán)境,最后通過μCT掃描骨密度值及HE染色觀察材料上細(xì)胞的成骨情況來評價(jià)不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的成骨能力。第三部分:(1)RNA測序了解Kaiso過表達(dá)及敲減后基因表達(dá)的變化情況:通過提取RNA,RNA質(zhì)量檢測,建立cDNA文庫,上機(jī)檢測,測序結(jié)果分析等步驟檢測Kaiso過表達(dá)及敲減后差異表達(dá)的基因。并進(jìn)一步進(jìn)行GO、KEGG分析探究差異基因富集到的生物過程及信號通路。(2)使用PI3K-Akt信號通路抑制劑并加入成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo),探究該信號通路是否參與Kaiso調(diào)控的成骨分化進(jìn)程。(3)Kaiso分子結(jié)合的目的基因預(yù)測及驗(yàn)證:根據(jù)生物信息學(xué)分析預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子Kaiso可能結(jié)合的目的基因,ChIP-PCR、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證Kaiso與Itga10啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合及對Itga10的表達(dá)調(diào)控。(4)Itga10敲減實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Itga10與PI3K-Akt信號通路及成骨分化的關(guān)系。四、研究結(jié)果第一部分:(1)通過HuProt蛋白芯片篩選強(qiáng)直性脊柱炎及正常人血漿,結(jié)果在強(qiáng)直性脊柱炎病人血漿中特異性篩選出MYLK,ASAP,SUGT1,BCL7A,EIF2C1,KAISO,IGHG17等蛋白自身抗體。(2)擴(kuò)大相應(yīng)樣本量利用MSD技術(shù)對其中感興趣的Kaiso蛋白抗體進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示早期AS患者體內(nèi)Kaiso抗體表達(dá)水平顯著高于正常人,晚期AS患者血漿內(nèi)表達(dá)水平與正常人無顯著差異。第二部分:(1)通過慢病毒感染技術(shù)成功構(gòu)建Kaiso基因過表達(dá)和敲減MC3T3-E1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。使用成骨誘導(dǎo)液分別對Kaiso過表達(dá)及敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行成骨誘導(dǎo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨化相關(guān)分子、堿性磷酸酶的表達(dá)量及活性、鈣結(jié)節(jié)形成等反映成骨分化能力的指標(biāo)在Kaiso過表達(dá)后被顯著抑制,而在Kaiso敲減后明顯增強(qiáng)。(2)裸鼠體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)證實(shí)Kaiso過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株體內(nèi)成骨能力低于對照,而Kaiso敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株體內(nèi)成骨能力與對照組相比顯著增強(qiáng)。第三部分:(1)對RNA測序所得的差異基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn),Kaiso過表達(dá)后下調(diào)的基因和Kaiso敲減后上調(diào)的基因均能夠富集到骨化相關(guān)生物過程。KEGG分析發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路在Kaiso過表達(dá)時(shí)被抑制,Kaiso敲減時(shí)被激活。其中Itga10的表達(dá)變化與PI3K-Akt信號通路變化一致。(2)PI3K-Akt信號通路抑制劑證實(shí)該通路參與Kaiso調(diào)控的成骨分化進(jìn)程。(3)ChIP-PCR、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)Kaiso可以通過結(jié)合存在于Itga10啟動(dòng)子區(qū)域的特異序列從而抑制Itga10的表達(dá)。(4)Itga10敲減實(shí)驗(yàn)證實(shí)Itga10的表達(dá)與PI3K-Akt信號通路成正相關(guān),敲減Itga10能夠抑制細(xì)胞的成骨分化。裸鼠體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)敲減Itga10對細(xì)胞成骨分化的抑制作用。結(jié)論本課題通過三個(gè)部分的研究揭示了Kaiso蛋白的自身抗體在早期強(qiáng)直性脊柱炎患者血漿內(nèi)高表達(dá),進(jìn)一步探究Kaiso分子與骨化這一強(qiáng)直性脊柱炎病理過程的關(guān)系,結(jié)果顯示Kaiso分子可通過結(jié)合Itga10來調(diào)控PI3K-Akt信號通路從而抑制成骨分化過程。這為強(qiáng)直性脊柱炎的早期診斷及骨化的干預(yù)治療提供了一個(gè)新的可能。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.23
【圖文】：

熒光信號中位數(shù)（F635 Median）扣除背景（B635）后用，則視為檢出，即血漿中存在相應(yīng)抗體可結(jié)合靶抗原蛋白公式為(Signal-Background)/SD，用于評價(jià)檢出的特異性自身抗體臨床大樣本驗(yàn)證原理步驗(yàn)證蛋白芯片篩選的結(jié)果，采用 Meso Scale Discovery（身抗體檢測試劑盒。MSD技術(shù)是基于電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assa的靈敏度和更寬的線性范圍，同時(shí)均一性好、信號穩(wěn)定。的含量時(shí)，實(shí)驗(yàn)原理是利用夾心法，即將重組蛋白包被在抗體的血清樣本，或陽性對照抗體，進(jìn)行孵育，再加入帶的二抗，最終利用電化學(xué)發(fā)光原理檢測[21, 22]。實(shí)驗(yàn)原理圖

1-2：芯片上 Kaiso 蛋白與血漿中相應(yīng)自身抗體結(jié)合陽性結(jié)果圖。a:AS 血漿篩選；b：對照組血漿篩選結(jié)果；c，d 分別為 AS 組和對照組兩組中箭頭所指位點(diǎn)放。（二）Kaiso（又稱 ZBTB33）自身抗體進(jìn)一步臨床樣本驗(yàn)證在挑選出的的自身抗體中，對相應(yīng)的抗原蛋白進(jìn)行進(jìn)一步篩查，發(fā)現(xiàn) Kaiso可能與 AS 發(fā)病中的骨化進(jìn)程關(guān)系密切。根據(jù)前述方法對 MSD 試劑盒檢測 Ka身抗體的條件進(jìn)行摸索，結(jié)果顯示 Kaiso 重組蛋白包被濃度為 5ug/ml，40ul/孔清稀釋濃度為 250 倍；二抗?jié)舛葹?1ug/ml；在以上條件下獲得的信號值高且背。陽性對照抗體濃度點(diǎn)設(shè)置為 2,500, 625, 156.25, 39.06, 9.77, 2.44, 0.61, 0 ng/m據(jù)以上陽性對照抗體濃度梯度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1-3。根據(jù)以上條件，應(yīng)用SD 試劑盒對早期 AS 患者血漿 30 例、晚期 AS 患者血漿 20 例、RA 患者血漿、正常人血漿 20 例進(jìn)行 Kaiso 自身抗體表達(dá)量的檢測，結(jié)果表示為 mean ±S平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤）。如圖 1-4 所示，Kaiso 血漿自身抗體表達(dá)量在早期 AS 病人

圖 1-3：Kaiso 自身抗體檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 1-4：Kaiso 自身抗體在不同組別人群血漿中的表達(dá)量。HC：healthy control, 正

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1 金s

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