【摘要】：目的:既往大量研究已經(jīng)證實(shí)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)可以引起內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和凋亡。AGEs導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要通過與細(xì)胞表面受體RAGE結(jié)合,從而激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)分子,尤其是通過導(dǎo)致NF-κB的表達(dá)上調(diào)引起后續(xù)炎癥反應(yīng)損傷。內(nèi)源分泌型游離晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(esRAGE)是RAGE基因變異剪接體,可以捕獲細(xì)胞外RAGE配體,阻斷細(xì)胞表面RAGE活化,從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。本課題通過基因重組使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Huvec)過表達(dá)esRAGE。通過測定內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子NF-κB,凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、Bax表達(dá)水平以及細(xì)胞凋亡情況,探討esRAGE對(duì)AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:(1)通過慢病毒載體構(gòu)建esRAGE基因過表達(dá)的Huvec:用過表達(dá)esRGAE的慢病毒感染Huvec,熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記蛋白GFP(綠色熒光蛋白)表達(dá)情況;qRT-PCR檢測病毒感染前后內(nèi)皮細(xì)胞esRAGE的RNA表達(dá)水平,ELISA法測定病毒感染前后內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中esRAGE蛋白質(zhì)表達(dá),以明確過表達(dá)esRAGE慢病毒是否成功轉(zhuǎn)入Huvec。(2)不同濃度AGEs對(duì)Huvec凋亡的影響:三種濃度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的AGEs、BSA,分別與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞孵育24h后。Hoechst-pi雙染法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,ipwin32軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞,并算出細(xì)胞凋亡率。(3)過表達(dá)esRAGE對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響:實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組,AGEs組,AGEs+control-virus組,AGEs+Lv-esRAGE(esRAGE過表達(dá)慢病毒)組。qRT-PCR、western-blot檢測前炎癥因子NF-κB,凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、Bax的RNA以及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.過表達(dá)esRAGE的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株構(gòu)建成功:a.慢病毒感染細(xì)胞GFP表達(dá)量達(dá)80%以上;b.過表達(dá)esRAGE的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的RNA的表達(dá)量是正常細(xì)胞的1532倍;過表達(dá)esRAGE組,對(duì)照組細(xì)胞上清液的esRAGE蛋白濃度分別為:233.80ng/ml±12.764 vs 0.18ng/ml±0.005,P0.001。2.用三種濃度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的AGE-BSA與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24h后,細(xì)胞凋亡率隨著AGEs濃度的升高而升高,細(xì)胞凋亡率分別為:(5.334+0.188)%vs(10.989+1.277)%vs(23.273+2.124)%,p0.001。提示AGE-BSA可以明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,且凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴性增高,故本課題采用200ug/ml AGEs作為誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡濃度。而BSA組中,三種濃度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的BSA孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h后,細(xì)胞凋亡率分別為:(2.062+0.355)%vs(2.312+0.244)%vs(2.287+0.163)%,與空白對(duì)照組((2.058+0.210)%)比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P=0.63。3.過表達(dá)esRAGE對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及機(jī)制探討。3.1過表達(dá)esRAGE對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:過表達(dá)esRAGE可以明顯減少AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡:AGEs+Lv-esRAGE(esRAGE過表達(dá)慢病毒)組的細(xì)胞凋亡率((2.151±0.002)%)明顯低于AGEs組((23.273±0.021)%),P0.001。AGEs+control virus組的細(xì)胞凋亡率((23.667±0.031)%)與AGEs組((23.273±0.021)%)相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p=0.839。3.2過表達(dá)esRAGE對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響:AGEs孵育上調(diào)凋亡相關(guān)因子Bax表達(dá),下調(diào)抗凋亡因子bcl-2表達(dá)水平。過表達(dá)esRAGE可以下調(diào)AGEs誘導(dǎo)的Bax表達(dá)水平,上調(diào)bcl-2表達(dá)水平。與對(duì)照組比較,AGE-BSA組的Bax RNA表達(dá)水平上調(diào)(1.003±0.075 vs 1.346±0.095,p=0.001)。AGE-BSA組與AGE-BSA+control virus組之間比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.346±0.095 vs 1.279±0.014,p=0.322)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE組與AGE-BSA組對(duì)比,Bax RNA表達(dá)水平下調(diào)(0.981±0.033 vs 1.346±0.095,p0.001)。與對(duì)照組比較,AGE-BSA組的Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào)(0.581±0.202 vs0.856±0.033,P=0.048)。AGE-BSA組與AGE-BSA+control virus組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.856±0.033 vs 1.013±0.091,p=0.221)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE組與AGE-BSA組對(duì)比,Bax蛋白表達(dá)水平下調(diào)(0.432±0.077 vs 0.856±0.033,P=0.007)。四組間bcl-2 RNA表達(dá)水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較,AGE-BSA組的bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)(0.720±0.086 vs 0.411±0.023,p=0.002)。AGE-BSA組與AGE-BSA+control virus組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.411±0.023 vs 0.383±0.074,p=0.704)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE組與AGE-BSA組對(duì)比,bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(0.755±0.081 vs 0.411±0.023,p=0.001)。3.3過表達(dá)esRAGE對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子NF-кB表達(dá)的影響:AGEs孵育促進(jìn)前炎癥因子NF-кB的表達(dá)水平,過表達(dá)esRAGE組可以下調(diào)NF-кB的表達(dá)水平。與對(duì)照組比較,AGE-BSA組的NF-кB RNA表達(dá)水平上調(diào)(1.004±0.080vs 1.300±0.127,p=0.016);蛋白表達(dá)水平上調(diào)(0.470±0.025 vs 0.926±0.170,P=0.018)。AGE-BSA組與AGE-BSA+control virus組之間比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,RNA(1.300±0.127 vs 1.260±0.119,p=0.690);蛋白質(zhì)(0.926±0.170 vs 0.985±0.230,p=0.709)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE組與AGE-BSA組對(duì)比,NF-кB RNA表達(dá)水平下調(diào)(0.918±0.041 vs 1.300±0.127,p=0.004);蛋白表達(dá)水平下調(diào)(0.410±0.109 vs 0.926±0.170,P=0.01)。結(jié)論:1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可以作為esRAGE基因載體,esRAGE基因轉(zhuǎn)染后的Huvec細(xì)胞能夠向外分泌esRAGE。2、AGEs能顯著誘導(dǎo)Huvec細(xì)胞凋亡,明顯增加Huvec細(xì)胞促凋亡因子Bax的表達(dá),下調(diào)抗凋亡因子bcl-2的表達(dá);過表達(dá)esRAGE可以明顯減少AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,下調(diào)Bax表達(dá)水平,上調(diào)bcl-2表達(dá)水平。3、AGEs能誘導(dǎo)Huvec細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng),明顯增加Huvec細(xì)胞炎癥因子NF-кB的表達(dá)水平,過表達(dá)esRAGE能夠明顯減輕AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng),明顯降低Huvec細(xì)胞NF-κB的表達(dá)。4、esRAGE對(duì)AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制主要通過下調(diào)促凋亡因子和炎癥因子表達(dá),上調(diào)抗凋亡因子表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2
【圖文】：

1.1 細(xì)胞株人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Huvec)委托上海中橋新舟購自 ATCC1.2 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)基因信息基因名稱：AGER(NM_001206940)物種：Human1.2.1 載體酶切載體信息:載體名稱：GV367元件順序：Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin克隆位點(diǎn)：AgeI/NheI載體圖譜：

結(jié)果1 過表達(dá) esRAGE 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后 esRAGE 表達(dá)情況過表達(dá) esRAGE 慢病毒，control 病毒轉(zhuǎn)染 Huvec 細(xì)胞 72h 后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)量達(dá) 80%以上(圖 3.1A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證病毒感染效果，經(jīng) Puromycin 篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，提取細(xì)胞 RNA，qRT-PCR 檢測 esRAGE mRNA 表達(dá)水平。確實(shí)，esRAGE 慢病毒轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)(圖 3.1B)。另外，ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中 esRAGE 蛋白濃度也發(fā)現(xiàn) esRAGE 慢病毒轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組表達(dá)明顯增高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖 3.1C)。表明過表達(dá) esRAGE 慢病毒已成功轉(zhuǎn)入 Huvec，且細(xì)胞向外分泌 esRAGE。

為了驗(yàn)證 AGE-BSA 對(duì) Huvec 細(xì)胞的影響并確定最佳孵育濃度，分別應(yīng)用三種濃度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的AGE-BSA孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)，Hoechst-pi 雙染法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下用 ZEN 軟件觀察并拍照,應(yīng)用ipwin32 軟件對(duì)總細(xì)胞以及凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，測定各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果證明AGE-BSA 可以明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，AGE-BSA 孵育組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，且凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴性增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)(圖 3.2.1A,B)，故本課題采用 200ug/ml 作為誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡濃度。另外，應(yīng)用對(duì)應(yīng)濃度的 BSA 孵育 Huvec 細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)（圖 3.2.1 A,B），證明 BSA 沒有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;3個(gè)原因讓你比同齡人老得快[J];家庭醫(yī)藥.快樂養(yǎng)生;2017年01期

2 齊佳昕;趙琳;孔令閣;王明磊;王鵬;任婕;王麟;;冠心舒通膠囊含藥血清對(duì)AGEs誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響[J];中藥藥理與臨床;2012年01期

3 王華富;桂志紅;葉一萍;許惠琴;;終末糖基化產(chǎn)物(AGEs)與糖尿病腎病的關(guān)系及中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展[J];海峽藥學(xué);2015年04期

4 吳佳蕾;許惠琴;譚真;李莉;陶玉菡;李偉;;生地黃-山茱萸對(duì)AGEs致HUVEC細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J];南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2013年03期

5 周燕瓊;金成;張英;;晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)形成途徑、檢測方法和抑制手段研究進(jìn)展[J];中國食品學(xué)報(bào);2013年06期

6 成永霞;劉貴波;郭素芬;楊向紅;;AGEs誘發(fā)體外大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2010年05期

7 孫紅艷;劉洪臣;;晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與衰老[J];中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

8 韓冰,王堅(jiān),朱荃;丹皮酚等對(duì)AGEs抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響[J];中醫(yī)藥學(xué)刊;2002年05期

9 唐靈;周康;王艷;張秋艷;;絞股藍(lán)皂苷對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2015年12期

10 文平凡;黃桂瓊;;黃連四物湯治療早期糖尿病腎病的臨床療效觀察及對(duì)血清AGEs水平的影響[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2011年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張偉;陸洪光;;脂溢性角化病與晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)及不同年齡段脂溢性角化病患者皮損AGEs含量比較[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十八次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2012年

2 吳丹;湯谷平;;晚期糖基化終末產(chǎn)物AGEs的免疫和遺傳研究[A];2013年全國高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)論文摘要集——主題I：生物高分子與天然高分子[C];2013年

3 黃國良;舒孟仙;;AGEs對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

4 姚興梅;王曉霞;張棟j;汪年松;;AGEs在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究[A];第十一屆全國中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

5 Shunrong Zhang;Yue Gao;;Effect of AGEs on the expression of mitochondrial dynamics related proteins in cultured human aortic endothelial cells[A];2015年老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2015年

6 戚世玲;朱定衡;薛汝增;吉蘇云;底大可;敖賢;何仁亮;;微粒皮種植對(duì)糖尿病潰瘍創(chuàng)面中AGEs、RAGE水平的影響[A];第15屆全國燒傷創(chuàng)瘍學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2018年

7 Huankai Yao;Chun Chen;Jingyu Duan;Chunping Zhang;Yan Li;Qunli Wei;;Discovery of Daphnoretin as AGEs Formation Inhibitor Through the Interaction with HSA[A];中國化學(xué)會(huì)第十一屆全國天然有機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集（第五冊(cè)）[C];2016年

8 袁揚(yáng);孫子林;周莉;;玉葵清對(duì)AGEs誘導(dǎo)人腎系膜細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響[A];2008中國醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)分泌代謝科醫(yī)師分會(huì)年會(huì)論文匯編[C];2008年

9 關(guān)美萍;薛耀明;卓鳳婷;沙建平;沈潔;;葡萄糖和AGEs聯(lián)合刺激對(duì)人單核細(xì)胞血紅素加氧酶-1表達(dá)的影響[A];2008中國醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)分泌代謝科醫(yī)師分會(huì)年會(huì)論文匯編[C];2008年

10 楊兵全;孫子林;王祥香;高峰;余江毅;劉蘇;胡源;;玉葵清含藥血清對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];全國中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 鄧儒元;Sp1在AGEs誘導(dǎo)消化道腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究[D];上海交通大學(xué);2017年

2 趙迪;蛋白-AGEs復(fù)合物的胃腸消化、酵解機(jī)制研究[D];華南理工大學(xué);2018年

3 鐘武;基于AGEs交聯(lián)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)血管硬化化合物的設(shè)計(jì)、合成和生物活性評(píng)價(jià)[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

4 王悅芬;AGEs在去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶中的作用及補(bǔ)腎方藥的調(diào)整作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2004年

5 張風(fēng)雷;葡萄籽原花青素抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子及RAGE表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2007年

6 邢影;AGEs及受體在糖尿病大鼠局灶腦缺血損傷中的作用機(jī)制[D];吉林大學(xué);2009年

7 張宜華;白藜蘆醇抑制AGEs誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成及血管平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

8 焦云根;血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）在晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用[D];東南大學(xué);2016年

9 孫慧琳;GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的拮抗作用及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李振宇;profilin-1在AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 伍成文;AGEs誘導(dǎo)自噬促進(jìn)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化[D];西南醫(yī)科大學(xué);2019年

2 李蘭芳;陳氏益腎健脾湯對(duì)糖尿病腎�。–KD2期） 脾腎氣虛證患者的療效觀察及對(duì)血清AGEs的影響[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2019年

3 史衛(wèi)東;AGEs、GSK3β、TRPM2對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞增殖影響的機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2019年

4 楊國民;內(nèi)源分泌型游離晚期糖化終末產(chǎn)物受體（esRAGE）對(duì)AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2018年

5 蘇國瑩;咖啡酸和綠原酸抑制AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[D];華南理工大學(xué);2018年

6 王五藝;AGEs通過JAK2/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

7 王緯宇;花色苷對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）生成及損傷HUVEC細(xì)胞的抑制作用研究[D];遼寧大學(xué);2018年

8 萬瑾舒;小檗堿對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的干預(yù)作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

9 張鑫鵬;黃連素通過MAPK信號(hào)通路抑制AGEs誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化[D];西南醫(yī)科大學(xué);2018年

10 馬宗艷;阿爾茨海默病、血管性癡呆的危險(xiǎn)因素分析及血清AGEs、sRAGE對(duì)其診斷價(jià)值[D];蘭州大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2781265