【摘要】：目的:代謝綜合征是(MS)由多系統(tǒng)代謝紊亂引起的一組慢性疾病綜合征,包括肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病和非酒精性脂肪肝病(NAFLD),已經成為危害全世界人類健康的嚴重問題。MS的特征是胰島素抵抗和持續(xù)存在的慢性低豐度性代謝性炎癥。脂肪組織被認為是代謝性炎癥的主要來源,而前脂肪細胞的數量占脂肪組織細胞的15-50%。近期研究還提示:在脂肪組織中募集巨噬細胞及促使促炎因子分泌的主要貢獻者并不是成熟的脂肪細胞,而是未分化的前脂肪細胞。CD36是一種調節(jié)多種免疫和代謝功能的清道夫受體,與MS的發(fā)生發(fā)展密切相關。因此,本研究擬觀察前脂肪細胞CD36在代謝性炎癥及MS中的作用,并初步探討其分子機制。方法:第一部分:人群健康調查數據來自于重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和金山分院門診體檢進行健康體檢的28035名患者:首先根據患者血清hs-CRP值對患者進行四分位數分組,分析不同程度炎癥狀態(tài)下血壓、血糖、血脂、肝功能的變化情況。然后,再根據體重系數、腰圍對患者進行四分位數分組,分析不同肥胖程度下患者的炎癥水平。人脂肪組織樣品來自于重醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院接受腹部手術的患者:根據是否患有MS,分為正常對照(normal)組代謝綜合征(MS)組。HE染色分析人脂肪組織病理改變,免疫組化染色測定人脂肪組織CD36、F4/80的蛋白表達,CD36和Pref-1的雙重染色分析CD36在人前脂肪細胞上的定位。第二部分:將6周齡C57BL/6J小鼠隨機分為C57BL/6J普通飲食組(CTL,n=8)和C57BL/6J高脂飲食組(HFD,n=8)。將6周齡野生型小鼠(WT-HFD,n=8)和CD36基因敲除小鼠(CD36KO-HFD,n=8)進行高脂飲食喂養(yǎng)。所有小鼠喂養(yǎng)14周,在喂養(yǎng)結束前一周做糖耐量試驗和胰島素抵抗試驗。喂養(yǎng)結束后,稱量體重和收集附睪脂肪組織樣本。CD36和Pref-1的雙重染色分析CD36在人前脂肪細胞上的定位,HE染色分析鼠脂肪組織病理改變;免疫組化染色測定鼠脂肪組織F4/80的蛋白表達。第三部分:FFA處理3T3-L1前脂肪細胞后,Western blot和單標流式檢測CD36蛋白水平。轉染慢病毒載體以建立CD36超表達的3T3-L1前脂肪細胞穩(wěn)定細胞系。油紅O和Bodipy染色分析細胞內脂質聚積情況;提取細胞蛋白,采用Western blot檢測細胞CD36、ACC、PACC、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1蛋白表達水平;提取細胞RNA,采用QPCR檢測前脂肪細胞炎癥/趨化因子mRNA表達水平;運用Transwell細胞遷移實驗檢測前脂肪細胞CD36超表達對THP-1細胞遷移的影響。第四部分:MitoSOX染色測定3T3-L1前脂肪細胞線粒體活性氧(mtROS)水平以評價線粒體氧化應激,JC-1染色測定3T3-L1前脂肪細胞線粒體膜電位(MMP)評價線粒體功能。Fluo-4/AM染色觀察胞內Ca~(2+)含量,Fluo-4/AM與mitotracker共染分析線粒體內鈣水平。使用2APB抑制IP3R介導的內質網向線粒體釋放鈣后,采用QPCR檢測前脂肪細胞炎癥/趨化因子mRNA的表達,應用Bodipy染色分析細胞內脂質沉積。結果:第一部分:健康調查數據顯示無菌性炎癥與多種代謝疾病呈正相關,BMI和腰圍與無菌性炎癥呈正相關(P0.05)。對于脂肪組織染色結果顯示,與正�；颊呦啾�,來自MS患者的脂肪組織中CD36蛋白和F4/80蛋白表達增加,且CD36和Pref-1的共定位效率更高,表明MS患者的前脂肪細胞CD36表達增加(P0.05)。第二部分:與CTL組相比,HFD喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠具有肥胖、脂肪肝、糖耐量異常與胰島素抗性(P0.05)。F4/80染色顯示HFD喂養(yǎng)誘導脂肪組織巨噬細胞浸潤增多、誘發(fā)脂肪組織炎癥(P0.05)。CD36和Pref-1的共定位分析表明:在HFD誘導的MS小鼠模型上前脂肪細胞CD36的表達被上調(P0.05)。DNA瓊脂糖凝膠電泳結果顯示CD36KO鼠模型構建成功。與WT-HFD相比,CD36KO并沒有減輕小鼠的體重與脂肪重(P0.05);但是卻緩解了HFD誘導的糖耐量異常與胰島素抵抗(P0.05),同時CD36KO還保護小鼠免受HFD誘導的脂肪組織巨噬細胞浸潤(P0.05)。第三部分:Western blot結果顯示:FFA時間依賴性地增加3T3-L1前脂肪細胞中的CD36表達(P0.05)。CD36-PE單標流式也表明FFA誘導3T3-L1前脂肪細胞CD36在膜上定位增加(P0.05)。用表達CD36的慢病毒載體轉染3T3-L1前脂肪細胞,CD36超表達增加FA的吸收,促進脂質合成,抑制lipophagy,促進前脂肪細胞內脂質積聚(P0.05)。CD36超表達還通過激活NF-κB p65和NLRP3炎性體介導炎癥反應(P0.05)。第四部分:JC-1與MitoSOX染色結果顯示:與NC相比,CD36超表達降低MMP、促進mtROS的產生,提示CD36超表達介導線粒體功能障礙(P0.05)。細胞內Ca~(2+)含量與分布實驗發(fā)現,CD36超表達增加細胞總Ca~(2+)和線粒體內Ca~(2+)水平(P0.05)。用IP3R抑制劑2APB處理3T3-L1前脂肪細胞,抑制內質網向線粒體釋放鈣,可以保護細胞免受CD36超表達誘導的線粒體功能紊亂,并減輕炎癥反應和脂質積聚,提示前脂肪細胞CD36通過IP3R介導的內質網向線粒體的鈣轉運,引起線粒體鈣超載并誘導炎癥反應(P0.05)。結論:體內實驗,在代謝綜合征(MS)患者或高脂誘導的MS小鼠模型中前脂肪細胞CD36表達增加伴脂肪組織巨噬細胞浸潤增多;CD36基因缺失可以減輕高脂誘導的胰島素抵抗和脂肪組織巨噬細胞浸潤。體外實驗,游離脂肪酸可以誘導CD36在前脂肪細胞中的表達;同時前脂肪細胞CD36超表達后,可以通過增加IP3R介導的內質網向線粒體的鈣轉運引發(fā)線粒體鈣超載,后者誘導線粒體功能障礙和mtROS的產生,進而促進NLRP3炎性體活化,從而誘導前脂肪細胞炎癥反應和募集巨噬細胞,參與脂肪組織代謝性炎癥的發(fā)生。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R589
【圖文】：

a) b) 對人群血糖的影響。a) Hs-CRP 對人群空腹血糖的影響;b) Hs-CR; *P <0.05 與第一四分位組比較，#P<0.05 第二四分位組比較，$P組比較。pacts of hs-CRP on blood glucose of the study human subjects. a) ting blood glucose of the study human subjects; b) Impacts of hs-Cbnormal blood glucose; *P < 0.05, versusthe first quartile; #P < 0.0third quartile; $P < 0.05, versus the third quartile.癥與血脂異常密切相關RP 的水平對研究人群進行四分位數分組，每組研究人群的.3。與低四分位數組相比，高四分位數組的 TG、TC 比低四 高（P<0.05）；同時，血脂異常的患病率伴隨 hs-CRP 的水

; e) Hs-CRP 對人群載脂蛋白 A 的影響;f）Hs-CRP 對人群載脂蛋白 B 的影響; g）Hs-C人群血脂異�；疾÷实挠绊�; *P <0.05與第一四分位組比較, #P<0.05第二四分位組比較第三四分位組比較。igure 1.3 Impacts of hs-CRP on the blood lipids of the study human subjects. a) Impactshs-CRP on TC; b) Impacts of hs-CRP on TG; c) Impacts of hs-CRP on LDL; d) Impacts s-CRPon HDL; e) Impacts of hs-CRPon apoA; f) Impacts of hs-CRP on apoB; g) Impacths-CRP on the prevalence of dyslipidemia; *P < 0.05, versus the first quartile; #P < 0.05versus the third quartile; $P < 0.05, versus the third quartile..2.4 無菌性炎癥炎癥與肝功能異常密切相關根據 hs-CRP 的水平對研究人群進行四分位數分組，每組研究人群的肝功能情況參見圖 1.4。盡管沒有嚴重的肝功能損害，但是隨著 hs-CRP 的逐漸增高白蛋白含量逐漸降低（P<0.05），白蛋白主要由肝臟合成；而且，肝功能受損 ALT、AST 水平伴隨 Hs-CRP 的水平成遞增趨勢（P<0.05）。

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文Pref1 是前脂肪細胞的標記分子，在前脂肪細胞上表達，在脂肪細胞上不表達。Pref1 和 CD36 的免疫熒光共定位染色提示，與正常人群相比， MS 患者的脂肪組織中 Pref1 和 CD36 表達上調且共定位顯著增多，說明 MS 患者前脂肪細胞 CD36表達上調（（圖 1.8，P<0.05）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李秀鈞,錢榮立;胰島素抵抗及其臨床意義[J];中國糖尿病雜志;1999年03期

本文編號：2781425