發(fā)布時(shí)間：2020-08-04 07:57

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥是危害老年人健康的主要因素之一,已成為危害人群死亡的第四大因素。作為一種系統(tǒng)性骨病,骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為骨量下降、骨微結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加等,可引引起患者全身關(guān)節(jié)酸痛、腰背疼痛甚至骨折,大大降低了患者的生活質(zhì)量,同時(shí)也給家庭、社會(huì)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)與壓力。隨著人口的老齡化的加速,預(yù)計(jì)到2020年,我國骨質(zhì)疏松患者將達(dá)到2.86億。骨質(zhì)疏松癥已迅速發(fā)展成為我國的一個(gè)公共健康問題,對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的正確認(rèn)識(shí)和早期干預(yù)迫在眉睫。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是骨重建中維持骨量最主要的兩種細(xì)胞。破骨細(xì)胞是人體內(nèi)唯一吸收骨質(zhì)的細(xì)胞,在生理情況下,與成骨細(xì)胞一起維持正常骨組織的代謝平衡。當(dāng)破骨細(xì)胞數(shù)量增加或者骨吸收功能增強(qiáng)時(shí),可引起包括骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、Paget骨病、腫瘤骨轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種由于骨量過度丟失而導(dǎo)致的常見疾病。深入開展破骨細(xì)胞研究在國內(nèi)國外均具有非常重要的臨床診療價(jià)值、基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。盡管傳統(tǒng)的藥物包括二磷酸鹽類(Bisphosphonate),降鈣素(Calcitonin),雌激素(Estrogen)和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)等均能一定程度上治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病,但尚存在骨壞死以及腫瘤等并發(fā)癥的報(bào)道。研發(fā)新型的具有靶向性和特異性的抗破骨細(xì)胞骨吸收藥物,減少其副作用,是下一步研究的方向。最近,天然提取物作為藥物在調(diào)控破骨細(xì)胞形成、預(yù)防和治療破骨細(xì)胞相關(guān)骨溶解疾病方面開始受到重視。在前期藥物對(duì)破骨細(xì)胞分化抑制篩選過程中,我們發(fā)現(xiàn)中藥單體藤黃酸能有效抑制破骨細(xì)胞的分化成熟和骨吸收功能。因此,本研究將進(jìn)一步深入研究藤黃酸在抑制破骨細(xì)胞分化成熟過程中的分子生物學(xué)機(jī)制,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究藤黃酸在預(yù)防和治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病中的作用,為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供充分的細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物學(xué)研究基礎(chǔ)。目的(1)研究藤黃酸在抑制破骨細(xì)胞分化成熟過程中的分子生物學(xué)機(jī)制；(2)將藤黃酸應(yīng)用于破骨細(xì)胞相關(guān)的骨溶解疾病動(dòng)物模型-小鼠OVX模型,在體內(nèi)證明該中藥單體的安全性和有效性；(3)為中藥單體臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。方法使用6周C57雌鼠的骨髓細(xì)胞作為細(xì)胞源,進(jìn)行破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng),利用TRAP染色,3個(gè)核染色陽性的細(xì)胞認(rèn)定為破骨細(xì)胞；使用CCK-8試劑盒測(cè)定藤黃酸對(duì)細(xì)胞的毒性,計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50；通過牛骨片吸收試驗(yàn)研究不同濃度藤黃酸對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收能力的影響,使用電鏡掃描牛骨片表面,然后對(duì)骨吸收區(qū)域進(jìn)行分析；使用qRCR來測(cè)定破骨細(xì)胞分化過程中特異性基因的表達(dá)量；使用蛋白電泳來測(cè)定GBA抑制破骨細(xì)胞分化與吸收功能的靶向信號(hào)通路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證藤黃酸在體內(nèi)對(duì)骨質(zhì)疏松的作用,我們建立了小鼠OVX骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。造模一周后,根據(jù)組別腹腔注射不同的液體每周兩次,連續(xù)四周。最后收集所有小鼠的雙側(cè)股骨和脛骨標(biāo)本,放入4%的多聚甲醛進(jìn)行固定,然后分別行組織學(xué)切片和micro-CT掃描分析。結(jié)果毒性試驗(yàn)證實(shí)在低于120nnM濃度的藤黃酸條件下,藥物對(duì)細(xì)胞活性不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。而當(dāng)藤黃酸濃度高于240nM時(shí),藥物對(duì)細(xì)胞活性有影響。同時(shí)我們計(jì)算出藤黃酸對(duì)BMMs的半數(shù)抑制濃度IC50為320nM。藤黃酸對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用呈濃度梯度依賴。我們將BMMs在無菌的牛骨片上進(jìn)行培養(yǎng),加入不同濃度的藤黃酸,結(jié)果空白組牛骨片上出現(xiàn)大量骨吸收,而在60nM組,骨吸收的區(qū)域減少到了約60%,在80nM組為20%,在120nM組幾乎看不到骨吸收現(xiàn)象。以此我們可以看出藤黃酸可抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能。我們將藤黃酸應(yīng)用于小鼠OVX模型,利用micro-CT、HE切片染色、TRAP切片染色觀察不同濃度藤黃酸對(duì)OVX小鼠的影響。OVX小鼠的BV/TV(骨體積分?jǐn)?shù))較正常小鼠有明顯的下降。不同濃度藤黃酸組的骨體積分?jǐn)?shù)比OVX對(duì)照組均有提高。并且藤黃酸的應(yīng)用提高了OVX小鼠的Tb.N(骨小梁數(shù)),降低了Tb.Sp(骨小梁間隙)。我們檢測(cè)了破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)情況,在RANKL的刺激下,這些基因的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的增高,但是在藤黃酸藥物組,基因表達(dá)有著不同程度的下降,并且藤黃酸對(duì)破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)抑制呈劑量和時(shí)間依賴相關(guān)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明藤黃酸在體外可以抑制破骨細(xì)胞的分化。我們研究了藤黃酸對(duì)破骨細(xì)胞分化相關(guān)的主要信號(hào)通路包括NF-κ.B、P13K/Akt和MAPK信號(hào)通路的影響。p38在RANKL刺激5min后出現(xiàn)磷酸化,而在藤黃酸藥物組中,p38的磷酸化出現(xiàn)了減弱。JNK出現(xiàn)了類似于p38的情況,Akt在RANKL刺激10min后出現(xiàn)了明顯的磷酸化,然后藤黃酸降低了Akt的這種磷酸化。另外,藤黃酸對(duì)于NF-κB和ERK的磷酸化沒有影響。P38和JNK的下游信號(hào)通路c-Fos和c-Jun在藤黃酸的作用下出現(xiàn)了明顯的降低。這些數(shù)據(jù)表明藤黃酸可能通過抑制p38、JNK和Akt通道來抑制破骨細(xì)胞的分化與功能。為了進(jìn)一步確認(rèn)該結(jié)果,我們?cè)谠囼?yàn)中添加了p38和JNK的激動(dòng)劑茴香霉素。同樣的,我們可以觀察到破骨細(xì)胞的形成在單獨(dú)使用藤黃酸的情況下被明顯抑制,而在同時(shí)加入藤黃酸和茴香霉素的實(shí)驗(yàn)組里,破骨細(xì)胞形成的抑制效應(yīng)被明顯降低。同時(shí)我們也看到在藤黃酸和茴香霉素共同作用組中,p38和JNK的磷酸化要明顯高于單獨(dú)使用藤黃酸的實(shí)驗(yàn)組。我們使用小鼠p38、JNK1和JNK2計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模型分析了藤黃酸是否在結(jié)構(gòu)上存在JNK和p38蛋白的結(jié)合位點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)藤黃酸與p38、JNK1和JNK2都存在較為合適的結(jié)合位點(diǎn)。以上數(shù)據(jù)表明,藤黃酸可以通過抑制p38和JNK信號(hào)通路來抑制破骨細(xì)胞的形成。結(jié)論本研究表明藤黃酸在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均可以抑制破骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞的骨吸收功能,從而我們推測(cè)藤黃酸具有治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病的潛在價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580
【圖文】：

先期研究中我們發(fā)現(xiàn)藤黃酸可科抑制破骨細(xì)胞的分化，所ＬN(yùn)B我們進(jìn)一步研究逡逑了藤黃酸是否可巧制破骨細(xì)胞的骨吸收作用。我們將ＢＭＭｓ細(xì)胞在無菌的牛骨逡逑片上進(jìn)行培養(yǎng)，加入不同濃度的藤黃酸，如圖２所示，空白組牛骨片上出現(xiàn)大量逡逑骨吸收，而在６０ｎＭ濃度的藤黃酸組，骨吸收的區(qū)域減少到了約６０％，在８０ｎＭ組逡逑為２０％，在１２０ｎＭ組幾乎看不到骨巧收現(xiàn)象。Ｗ此我們可科看出藤黃酸可巧制破逡逑骨細(xì)胞的骨吸收功能。逡逑■Ａ栜自逡逑，b8逡逑１７逡逑

誘導(dǎo)的ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞釋放促炎因子ｔｉｉ’ｉ２１。所Ｗ我們撿測(cè)了邋ＧＢＡ對(duì)促炎因子釋放逡逑的抑制作用是否是通過減少ＮＯ的生成達(dá)成的，我們通過撿測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中逡逑的亞硝酸鹽（ＮＯ２－）含量來間接判定ＮＯ的量。如圖２Ａ所示，８０ｎＭ和１６０ｎＭ的逡逑ＧＢＡ可Ｗ抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)量。蛋白電泳表明１６０ｎＭ的ＧＢＡ可Ｌ義明顯巧制ｉＮＯＳ逡逑的表達(dá)（圖述）。］＾？８可＾通過激活師－濁信號(hào)遁路來提高ｉＮＯＳ和ＮＯ的表達(dá)逡逑所Ｗ我們槍測(cè)了邋ＧＢＡ處理之后ＮＦ－ｋＢ信號(hào)通路的激活情況。如圖２Ｃ所示，ＬＰＳ逡逑雖著激活轉(zhuǎn)染了邋ＮＦ－ｋＢ巧光素酶的ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞的ＮＦ－ｋＢ表達(dá)，而１６０ｎＭ的逡逑�。量丧霳B巧制ＮＦ－ｋＢ的激活。蛋白電泳表明１６０ｎＭ的ＧＢＡ可１＾義顯著抑制ＬＰＳ逡逑誘導(dǎo)的降解（圖２Ｄ）。逡逑然而，在化濃度（２０ｎＭ、４０ｎＭ和８０ｎＭ）的ＧＢＡ作用下，ＮＯ和ｉＮＯＳ的逡逑表達(dá)并沒有改變，而且ＮＦ－ｋＢ信號(hào)通路在此濃度的ＧＢＡ作用下依舊處于激活狀態(tài)。逡逑但是高濃度（１２０ｎＭ）的ＧＢＡ可１＾NB抑制ＮＦ－ｋＢ信號(hào)通路的激活，同時(shí)巧制ｉＮＯＳ和逡逑ＮＯ的表達(dá)。逡逑５９逡逑

先期研究中我們發(fā)現(xiàn)藤黃酸可科抑制破骨細(xì)胞的分化，所ＬN(yùn)B我們進(jìn)一步研究逡逑了藤黃酸是否可巧制破骨細(xì)胞的骨吸收作用。我們將ＢＭＭｓ細(xì)胞在無菌的牛骨逡逑片上進(jìn)行培養(yǎng)，加入不同濃度的藤黃酸，如圖２所示，空白組牛骨片上出現(xiàn)大量逡逑骨吸收，而在６０ｎＭ濃度的藤黃酸組，骨吸收的區(qū)域減少到了約６０％，在８０ｎＭ組逡逑為２０％，在１２０ｎＭ組幾乎看不到骨巧收現(xiàn)象。Ｗ此我們可科看出藤黃酸可巧制破逡逑骨細(xì)胞的骨吸收功能。逡逑■Ａ栜自逡逑，b8逡逑１７逡逑

本文編號(hào)：2780265