【摘要】：中藥有效成分β-細辛醚、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷GRb1等均具有抗氧化、抗凋亡、抑制細胞自噬等作用,其效果有助于細胞存活,發(fā)揮細胞保護作用。蕨麻具有益氣補血、滋補強身、健脾和胃、滋陰養(yǎng)腎之功效,其活性成分蕨麻多糖(potentilla anserine polysaccharide,PAP)具有抗氧化、抗缺氧及免疫調(diào)節(jié)作用。以PAP抗氧化藥效為切入點,探索鎘(Cadmium,Cd)的神經(jīng)毒性和PAP的保護作用是極其必要的。Cd是一種有毒重金屬,經(jīng)消化道、呼吸道或皮膚接觸,進入機體成為外源性化學(xué)致毒物質(zhì)。因其生物半衰期可長達10~20年,極易蓄積于體內(nèi)各組織器官。Cd的致毒性與其理化特性有關(guān),除半衰期長外,還與它的離子半徑(97 pm)有關(guān),Ca~(2+)半徑99 pm,與Cd~(2+)極為相似。Cd~(2+)進入細胞內(nèi)可導(dǎo)致Ca~(2+)的結(jié)合位點或離子通道被其取代,也可與Zn~(2+)、Fe~(2+)等離子競爭蛋白分子的結(jié)合位點或離子通道等損傷組織細胞,引起持續(xù)性病理變化。神經(jīng)毒性是指外源性化學(xué)物質(zhì)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損害。Cd的神經(jīng)毒性,首先導(dǎo)致組成血腦屏障的血管內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞和脈絡(luò)叢損傷,破壞血腦屏障的完整性及增加其通透性,之后更多的Cd進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并長期蓄積,導(dǎo)致神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)改變、線粒體損傷、DNA斷裂、細胞死亡等。現(xiàn)已報道的有關(guān)Cd神經(jīng)毒性的機制,大部分為通過Cd誘導(dǎo)體外培養(yǎng)細胞凋亡的研究,認(rèn)為Cd的神經(jīng)毒性主要源于其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng),線粒體雙層膜脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和功能的改變,如線粒體膜電位變化等,因此線粒體必然成為Cd毒性作用的靶點。Cd競爭性抑制Ca~(2+)通過電壓依賴性門控通道的轉(zhuǎn)運,電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)的開關(guān)狀態(tài),對線粒體膜內(nèi)外代謝物分子和離子的流動效率產(chǎn)生明顯的影響,當(dāng)VDAC開放時,Ca~(2+)易于經(jīng)VDAC流入線粒體,從而導(dǎo)致線粒體腫脹、凋亡發(fā)生。綜上所述,Cd神經(jīng)毒性作用主要源于其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和競爭性抑制Ca~(2+)通道,影響線粒體膜及其離子流動。傳統(tǒng)藏藥蕨麻對各種原因?qū)е碌哪X缺氧性損傷具有保護作用,其機制與清除自由基、抑制氧化應(yīng)激損傷以及改善線粒體功能密切相關(guān)。根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的性味功效和現(xiàn)代藥理學(xué)分析,蕨麻有可能成為一種新的對抗Cd神經(jīng)毒性藥物。目的:首次選用蕨麻主要活性成分PAP,干預(yù)Cd染毒神經(jīng)細胞和小鼠,探討Cd對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損傷機制及其PAP可能的保護作用,為進一步認(rèn)識Cd的神經(jīng)毒性作用、預(yù)防和治療Cd中毒以及蕨麻的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。方法:1.選用小鼠腦神經(jīng)瘤細胞(N2a)、人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)和BALB/c小鼠為實驗對象。2.Cd梯度濃度染毒建立細胞和小鼠染毒模型,并確定致毒劑量。PAP梯度濃度給藥,選擇并確定最有效劑量。3.測定腦體系數(shù)、宏觀觀察動物腦與其他臟器的大體變化;顯微和超微觀察培養(yǎng)的神經(jīng)細胞和動物腦細胞的形態(tài)變化;CCK-8檢測細胞細胞生存率,熒光法和流式細胞術(shù)觀察并檢測細胞核形改變、細胞凋亡率、活性氧(ROS)、線粒體膜電位(MMP)和細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca~(2+)]i);AO和MDC染色觀察細胞酸性自噬泡和晚期自噬溶酶體。比色法測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)和過氧化氫(H_2O_2)含量、Na~+K~+-ATPase、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATPase及總ATPase活性;免疫印跡、免疫組化及免疫熒光分析等檢測凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達。結(jié)果:1.Cd染毒細胞和動物,除動物出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及臟器和腦體系數(shù)變化外,細胞的凋亡和死亡率增加;PAP干預(yù),染毒動物的癥狀、肝脾損傷減輕、腦體系數(shù)降低,細胞的凋亡和死亡率下降。2.Cd的神經(jīng)毒性作用與氧化應(yīng)激有關(guān)。ROS水平隨Cd濃度的增加而升高,SOD活性顯著降低,MDA、CAT、H_2O_2水平均明顯增高;PAP干預(yù)可使ROS水平下降、MDA、CAT、H_2O_2水平降低,SOD活性上升。結(jié)果表明,PAP可抑制Cd神經(jīng)毒性導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。3.Cd染毒細胞和動物[Ca~(2+)]i明顯增加,誘導(dǎo)CaMK II、Akt和mTOR磷酸化水平顯著增高;PAP干預(yù)[Ca~(2+)]i減低,能降低CaMK II、Akt和mTOR磷酸化水平,通過維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),抑制Akt/mTOR信號通路激活,抑制細胞凋亡。4.Cd染毒細胞和動物腦細胞的超微結(jié)構(gòu)變化以核皺縮、碎裂,線粒體嵴模糊、呈空泡狀,可見凋亡小體為主。染毒細胞的MMP降低或消失,Na~+K~+-ATPase、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATPase及總ATPase活性降低,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達下降,Bax表達增高,Bcl-2/Bax比值降低,Cyt C,AIF的表達增高、Cleaved caspase-3蛋白和Cleaved PARP蛋白的表達增加。PAP干預(yù)可使細胞超微結(jié)構(gòu)改善,MMP恢復(fù),Na~+K~+-ATPase、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATPase及總ATPase活性增加,Bcl-2/Bax比值上升,Cyt C、AIF的表達增高、Cleaved caspase-3蛋白和Cleaved PARP蛋白的表達增加,表明PAP能激活神經(jīng)細胞的抗凋亡蛋白,抑制caspase依賴性凋亡途徑和caspase非依賴性凋亡途徑,從而抑制細胞凋亡。5.Cd染毒細胞和動物腦細胞的超微結(jié)構(gòu)可見大量的自噬泡,Cd染毒細胞AVOs、自噬溶酶體增多,FJB染色定性變性細胞增多。Bcl-2、p62蛋白表達水平顯著降低,PI3K class III、Beclin-1、LC3 II表達水平顯著升高;動物腦組織也出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白變化,而且LC3免疫熒光分析顯示小鼠皮質(zhì)和海馬CA1、CA3及Hilus區(qū)神經(jīng)細胞中LC3在核周點狀聚集較對照組顯著增加,且在海馬區(qū)CA3CA1Hilus區(qū)。PAP干預(yù),能顯著減少酸性自噬泡形成及改善胞質(zhì)空泡化,增高Bcl-2和p62表達,降低PI3K class III、Beclin-1及LC3 II的蛋白水平,同時抑制LC3 I向LC3 II的轉(zhuǎn)化,聯(lián)合使用自噬抑制劑LY 294002效果更佳。結(jié)論:1.Cd對神經(jīng)細胞和小鼠腦細胞均具有毒性作用,PAP能拮抗Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。2.Cd神經(jīng)毒性源于氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡,PAP可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣離子平衡。3.Cd神經(jīng)毒性以細胞凋亡及自噬性死亡為主,PAP的保護作用與抑制凋亡及自噬性死亡密切相關(guān)。4.Cd神經(jīng)毒性誘導(dǎo)凋亡的途徑可能是線粒體介導(dǎo)的Caspase依賴性和Caspase非依賴性凋亡途徑,以Akt/mTOR信號通路調(diào)控細胞凋亡為主。PAP的抗凋亡作用與穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣離子平衡、保護線粒體膜等作用有關(guān)。5.Cd神經(jīng)毒性誘導(dǎo)細胞自噬的途徑可能是PI3K III/Beclin-1信號通路,PAP通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)因子抑制細胞自噬性死亡。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R595.2
【圖文】：

第三章 結(jié)果毒誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡的毒性實驗毒對神經(jīng)細胞活性的影響表 3-1 不同濃度 Cd 染毒 24 h 細胞存活率（%）1 The cell viability with Cd of different concentrations at culturing 2Cd μM N2a SH-S0 100.00±0.00 100.005 101.83±3.19 103.1110 91.39±2.13** 87.54±20 83.20±2.17** 75.79±30 67.69±3.55** 58.82±40 40.84±3.29** 35.13±50 34.42±2.13** 27.33±比較*p<0.05，** p<0.01（下同）

蘭州大學(xué)博士研究生學(xué)位論文 蕨麻多糖干預(yù)對鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡和自噬的影響3.1.2 Cd 染毒對神經(jīng)細胞凋亡的影響3.1.2.1 Cd 染毒對神經(jīng)細胞凋亡率的影響表 3-2 不同濃度 Cd 染毒的細胞凋亡率Table 3-2 The apoptosis rate with Cd of different concentrations（%）Cd μM LL LR UR ULN2a 0 98.27±0.15 0.35±0.45 0.71±0.13 0.67±0.0910 13.23±2.59** 75.5±0.72** 11.0±1.84* 0.27±0.0520 13.95±1.33** 65.62±2.20** 19.89±3.18** 0.54±0.1530 11.92±2.18** 53.66±1.57** 34.00±3.32** 0.42±0.10SH-SY5Y 0 98.84±0.43 0.38±0.38 0.49±0.32 0.28±0.0610 18.11±1.38** 71.92±1.86** 9.56±3.03* 0.40±0.0420 11.06±1.58** 55.86±2.11** 30.37±2.12** 0.71±0.1330 6.73±1.08** 46.56±3.14** 46.18±4.50** 0.52±0.11

活細胞隨 Cd 濃度增加而減少（viablenon-apoptoticcell,VNA），壞死細胞（ULnon-viable non-apoptotic cell, NVNA）的比例無顯著性增高，兩種細胞的凋亡率均增加，其中，晚期凋亡細胞（non-viableapoptoticcell,NVA）隨 Cd濃度增加而增多，SH-SY5Y 細胞更明顯，早期凋亡細胞（viableapoptoticcell,VA）增多以 Cd 10 μM 時最為明顯（超過 60 %），之后，隨濃度增加而逐漸下降。由此表明，凋亡細胞的數(shù)量增加與 Cd 濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。SH-SY5Y 細胞對鎘毒性更敏感。3.1.2.2 Cd 染毒對神經(jīng)細胞核形的影響不同濃度 Cd 染毒 N2a 和 SH-SY5Y 細胞 24h，Hochest33258 染色，熒光顯微鏡觀察如圖 3-3 所示：對照組細胞核大，呈圓形或卵圓形，邊界清晰，染色質(zhì)分布均勻，核仁完整；染鎘組細胞核染色質(zhì)分布不均勻，部分細胞核體積縮小，有的呈現(xiàn)新月形，部分胞核呈致密濃染的固縮，出現(xiàn)凋亡小體，至 30μM 時細胞核有碎塊狀致密熒光出現(xiàn)，細胞的數(shù)量明顯減少，以上改變均隨 Cd 濃度的增高而加重。由此說明，鎘神經(jīng)細胞毒性引發(fā)細胞核形的變化，Cd 誘導(dǎo)了細胞凋亡。

【參考文獻】

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本文編號：2776471