【摘要】：第一部分人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定目的:分離、培養(yǎng)來(lái)自胎盤(pán)羊膜組織的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(h AMSCs),在流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)下進(jìn)行免疫篩選鑒定人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備良好的干細(xì)胞移植材料。方法:無(wú)菌技術(shù)支持下獲取遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康足月產(chǎn)婦新鮮娩出的胎盤(pán),通過(guò)羊膜組織的雙酶(胰蛋白酶+I型膠原酶)消化分離獲得單個(gè)細(xì)胞,在混入10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基中貼壁篩選、純化、體外傳代,鏡下分別每日觀察三代細(xì)胞增殖狀態(tài)及形態(tài)變化。使用流式細(xì)胞表面分選儀對(duì)P3代的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志CD90,CD105,CD44,CD73鑒定。結(jié)果:人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞呈單純貼壁生長(zhǎng),呈纖維條狀,細(xì)長(zhǎng)梭形。細(xì)胞流式顯示:第三代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD90,CD105,CD44,CD73,低表達(dá)或不表達(dá)CD34,CD11b,CD19,CD45和HLA-DR。結(jié)論:體外條件下成功分離出人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,并可體外短期穩(wěn)定增殖和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。第二部分人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植對(duì)哮喘小鼠氣道Muc5ac表達(dá)的影響目的:探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(h AMSCs)靜脈移植對(duì)哮喘小鼠氣道Muc5ac表達(dá)的影響。方法:將40只6-8W雌性BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字標(biāo)記法分為正常組(NS組)、哮喘組(AS組)、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組(AS+h AMSCs)、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞自身對(duì)照組(NS+h AMSCs)、地塞米松干預(yù)組(AS+DEX),每組8只。AS組于第1、13天予OVA溶液腹腔、頸部皮下注射致敏,第19d在自制的霧化籠內(nèi)霧化吸入10%OVA溶液連續(xù)激發(fā)5d,末次激發(fā)24h后取材。NS組用生理鹽水代替OVA溶液,余同AS組;AS+h AMSCs組在第1次致敏后第18d通過(guò)尾靜脈注射Brdu標(biāo)記的P3人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞懸液(1×106)0.25ml/只,余處理同AS組;NS+h AMSCs組第18d經(jīng)尾靜脈注射Brdu標(biāo)記的P3人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞懸液(1×106)0.25ml/只,余處理同NS組;AS+DEX組于每日霧化激發(fā)前30min,予地塞米松2mg/kg腹腔皮下注射,余處理同AS組;觀察各組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和瑞氏-吉姆薩細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù),ELISA檢測(cè)IL-5、IL-12、IL-17程度變化,免疫熒光技術(shù)觀察人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)Brdu標(biāo)記陽(yáng)性率及人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)定植情況;HE染色觀察比較各組肺組織病理學(xué)變化,AB-PAS染色觀察氣道上皮組織杯狀細(xì)胞及黏液物質(zhì)變化情況,蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)肺組織Muc5ac蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:免疫抗體熒光技術(shù)在AS+h AMSCs組和NS+h AMSCs組均可追蹤到人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠肺內(nèi)定植,其中AS+h AMSCs組追蹤到人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在肺組織內(nèi)定植較NS+h AMSCs組明顯。AS+h AMSCs組BALF細(xì)胞總計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞占比、IL-5、IL-17表達(dá)水平、氣道周?chē)装Y浸潤(rùn)程度評(píng)分、氣道上皮組織杯狀細(xì)胞數(shù)量和黏液物質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性相對(duì)著色面積(IOD值)、肺組織Muc5ac蛋白表達(dá)水平均較AS組降低(P0.01);較NS組增高(P0.01)。IL-12表達(dá)水平較AS組升高,但較NS組低(P0.01)。NS+h AMSCs組與NS組比較,各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)差異(P0.05)。結(jié)論:1.外源性人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植可定向歸巢至小鼠肺內(nèi),且以哮喘小鼠較為明顯。2.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)哮喘小鼠可通過(guò)降低氣道炎癥及氣道Muc5ac的表達(dá)水平,其機(jī)制可能是人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用減輕氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),抑制IL-5、IL-17的表達(dá)水平及促進(jìn)IL-12表達(dá),進(jìn)而抑制各炎癥因子的表達(dá),導(dǎo)致氣道Muc5ac的表達(dá)下降。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25
【圖文】：

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 翁敏華1.3.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)1）產(chǎn)婦及胎兒術(shù)前各項(xiàng)檢查均無(wú)異常并簽署獲取廢棄胎盤(pán)羊膜組織的知情同意書(shū)，采集足月孕產(chǎn)婦新鮮娩出的胎盤(pán)，參照 Magatti 及陳勇等的方法[36-37]分離出人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞；2）穿戴無(wú)菌手套，鋪無(wú)菌單，先用加入了 P/S 雙抗的 D-Hank’s 液充分洗凈胎盤(pán)的胎兒面，聯(lián)合使用無(wú)菌手術(shù)刀和鑷子剝離羊膜，邊剝離邊用剩余的 D-Hank’s 液繼續(xù)沖洗。將完全剝離出來(lái)的胎兒面羊膜浸入 D-Hank’s 液并低溫轉(zhuǎn)運(yùn)，迅速帶入實(shí)驗(yàn)室；見(jiàn)圖 1、圖 2。

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 翁敏華1.3.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)1）產(chǎn)婦及胎兒術(shù)前各項(xiàng)檢查均無(wú)異常并簽署獲取廢棄胎盤(pán)羊膜組織的知情同意書(shū)，采集足月孕產(chǎn)婦新鮮娩出的胎盤(pán)，參照 Magatti 及陳勇等的方法[36-37]分離出人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞；2）穿戴無(wú)菌手套，鋪無(wú)菌單，先用加入了 P/S 雙抗的 D-Hank’s 液充分洗凈胎盤(pán)的胎兒面，聯(lián)合使用無(wú)菌手術(shù)刀和鑷子剝離羊膜，邊剝離邊用剩余的 D-Hank’s 液繼續(xù)沖洗。將完全剝離出來(lái)的胎兒面羊膜浸入 D-Hank’s 液并低溫轉(zhuǎn)運(yùn)，迅速帶入實(shí)驗(yàn)室；見(jiàn)圖 1、圖 2。

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 翁敏華傳代培養(yǎng)可獲得較純的干細(xì)胞。傳代后的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，2 小時(shí)左右開(kāi)始貼壁，3-4 天即可鋪滿(mǎn)瓶底，其形態(tài)呈單層放射狀或螺旋狀緊密排列，與原代細(xì)胞接近。傳至 P3，細(xì)胞及核占比增加，形態(tài)結(jié)構(gòu)仍呈旋渦狀、長(zhǎng)梭形緊密排列。見(jiàn)圖 3、圖 4。

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉傳合;洪建國(guó);尚云曉;孫王君;多力坤·木扎帕爾;扇敏娜;高云;任筱

本文編號(hào)：2767582