【摘要】：第一部分高通量轉錄組深度測序分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞的分子異質性和關鍵基因功能的初步探索研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一種自身免疫性疾病,表現為多個器官及系統(tǒng)受累,其中包括腎臟、皮膚、關節(jié)和神經系統(tǒng)等的炎癥反應,疾病的活動度隨著病情波動而不斷變化,同時出現抗核抗體等多種自身抗體。SLE的病因和誘導因素是多種多樣的,其中包括遺傳因素、環(huán)境因素、感染因素以及精神因素等多個方面,其中遺傳因素有著重要的作用。而在SLE的治療過程中,還沒有一個特異性治療方法,只能以緩解病情為目的進行治療和控制,長期的炎癥狀態(tài)和藥物副作用嚴重影響著患者生活質量。因此針對SLE的發(fā)病機制,探索其遺傳學病因及功能顯得尤為重要。本課題組前期通過外顯子芯片研究、基因組關聯(lián)研究(Genome Wide Association Study,GWAS)在中國漢族人群已經篩選發(fā)現多個新的SLE的易感基因及位點,揭示了 SLE部分遺傳易感機制。而GWAS分析發(fā)現的只是基因變異與疾病風險之間一種統(tǒng)計學證據,由于基因組連鎖不平衡,所篩選出的易感功能性基因及致病機理大多不明。為了實現從統(tǒng)計學證據到疾病發(fā)病機理的跨越,揭示疾病機制,需要開展功能性基因轉錄組的篩選鑒定以及基因功能探索研究。研究目的:本研究旨在篩選SLE差異表達的易感基因,初步探索其在疾病中的功能及可能的作用機制。研究方法:1.在SLE患者及健康對照個體外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中開展高通量RNA-seq測序分析及差異性表達驗證;2.利用磁珠分選人PBMC中的CD3+T細胞和CD14+單核細胞,Q-PCR檢測并篩選目的基因的表達差異;3.體外實驗中,在THP1、U937單核細胞系、PMA誘導U937細胞分化的巨噬細胞中,通過IFN-γ及LPS刺激炎癥反應,利用Q-PCR分別檢測TCN2基因的轉錄水平變化。研究結果:1.RNA-seq測序分析結果發(fā)現,與對照組相比,SLE患者PBMC細胞中共篩選出2146個差異基因,其中1040個基因表達上調,1106個基因表達下調,以p0.05為差異有統(tǒng)計學意義;設計引物對統(tǒng)計學差異基因較大的20個基因,在SLE和對照組中的表達水平進行Q-PCR驗證,結果證實差異基因表達與RNA-seq測序篩查預測結果一致。2.通過檢測SLE患者CD3+T細胞和CD14+單核細胞中差異基因表達水平,證實在SLE患者T細胞中IFI6基因表達顯著上調,在單核細胞中RNASE1和TCN2表達異常。3.體外實驗證實IFN-γ和LPS刺激炎癥反應下,可以促進TNC2在單核細胞系和誘導的巨噬細胞中表達上調。研究結論:在SLE患者PBMC的RNA-seq測序分析中,最終篩查出差異表達的基因2146個,其中上調的有1040個,表達下調的有1106個基因。對20個差異基因的Q-PCR實驗驗證結果與測序分析結果一致。在CD3+T細胞和CD14+單核細胞中,TCN2基因和RNASE1基因表達差異明顯,提示這兩個基因可能成為潛在的診斷、判斷疾病活動度及預后的分子標志物。TCN2可能成為調節(jié)炎癥通路關鍵基因,為SLE治療和基因組學的功能研究提供了新的潛在靶點。第二部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感基因HLA-DR3和HLA-DR15與發(fā)病風險的關聯(lián)分析研究目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為一種遺傳性自身免疫病,遺傳因素在其發(fā)病的過程中占有重要的位置,越來越多的研究表明HLA-DRB1的基因多態(tài)性與SLE有著密切的關聯(lián)性,本研究旨在運用薈萃分析方法綜合評估HLA-DRB1基因的兩種基因型(HLA-DR3和HLA-DR15)與SLE發(fā)病易感性的相關性。研究方法:截至 2018 年 6 月,從 PubMed,Elsevier Science,Springer Link,Medline和Cochrane圖書館數據庫中搜索HLA-DRB1和SLE的研究,通過STATA14.0軟件建立隨機效應模型,利用比值比(OR)與95%置信區(qū)間(CI)進行相關性分析。研究結果:本研究共計納入23項研究,其中包括5261例SLE病例和9838例對照樣本�？傮w分析顯示HLA-DR3和HLA-DR15多態(tài)性與SLE疾病易感性存在有較強相關性(OR:1.60,95%CI:1.316-1.934,p=0.129 和 OR:1.68,95%CI:1.334-2.112,p=0.001)。亞組分析證明了 HLA-DR3 和 HLA-DR15 多態(tài)性的異質性來源中,種族差異是重要原因之一。白種人與HLA-DR3關聯(lián)研究中無統(tǒng)計學差異(OR:1.60,95%CI1.320-1.960,p=0.522),而東亞人群特異性參與了HLA-DR15 與 SLE發(fā)病異質性的構成(OR:1.65,95%CI:1.248-2.173,p=0.001)。此外,樣本人群來源是參與形成HLA-DR3和HLA-DR15多態(tài)性異質性的另一個因素。在HLA-DR3的異質性研究中,社區(qū)人群的樣本來源參與構成異質性(OR:1.65,95%CI:1.37-1.99,p0.01)。在HLA-DR15異質性分析中,社區(qū)來源的樣本以及醫(yī)院來源的樣本都參與構成異質性來源(OR:1.378,95%CI:1.078-1.760,p0.01 和 OR:2.08,95%CI:1.738-2.49,p0.01)。研究結論:HLA-DRB1基因可能是SLE的易感基因,其兩個基因型HLA-DR3和HLA-DR15與SLE存在顯著相關性。第三部分兩種單基因遺傳性皮膚病家系的基因突變分析:一個掌跖角化癥家系基因突變分析研究;一個遺傳性反甲伴有白甲家系基因突變分析研究第一節(jié)一個掌跖角化癥家系基因突變分析研究研究背景:掌跖角化癥(palmoplantarkeratoderma,PPK)為一種單基因病,遺傳方式以常染色體顯性遺傳為主,主要表現為掌跖部位皮膚角化過度,角質層增厚,表皮各層增生,根據其臨床表型的不同可以分為多種亞型,根據皮損形態(tài)可分為點狀掌跖角化癥、條紋狀掌跖角化癥、局灶型掌跖角化癥,彌漫性掌跖角化癥,根據發(fā)病特點可以分為單發(fā)型或合并其他系統(tǒng)疾病以綜合征形式發(fā)病,其中綜合征,不乏包含有致死性疾病如遺傳性大皰性表皮松解癥,心肌病等,因此僅僅靠臨床表現來精準的判斷掌跖角化癥的亞型是十分困難的。有文獻報道,DSP基因致病突變可以使部分掌跖角化癥患者伴有羊毛狀卷發(fā),擴張型心肌病、遺傳性大皰性表皮松解癥、廣泛淺表性膿皰病等多種并發(fā)癥狀。DSP基因,編碼Desmoplakin蛋白質,參與形成細胞內的細胞骨架接頭,功能失調可以導致皮膚增殖紊亂,因此,通過基因檢測技術結合其他輔助檢查技術,對疾病亞型進行精準的判斷,發(fā)現并探索致病基因及突變的類型及功能,對于遺傳性皮膚病的精準診療起到了十分重要的作用。研究目的:收集一個中國漢族條紋狀掌跖角化癥家系,對該家系的致病基因、突變及臨床表型進行分析,結合皮膚鏡、皮膚反射式共聚焦(RCM)檢查、組織病理學等多維手段探索掌跖角化癥臨床表型,以更加精準探討掌跖角化癥致病基因、突變與臨床表型的關系,并進行轉錄組表達探索。研究方法:(1)采集一個掌跖角化癥家系4名成員的外周血,使用Sanger測序的方法對該家系中2名患者進行基因突變檢測,以家系中2名健康家系成員和100名無親緣關系的正常人作為對照(2)通過皮膚鏡、RCM以及組織病理學等多種輔助診斷方案進行檢查,建立和豐富掌跖角化癥多維皮膚影像資源庫。研究結果:(1)該家系中,DSP基因編碼區(qū)發(fā)現一個新的雜合錯義突變c.3550 CT,從而導致色氨酸(Trp,W)突變?yōu)榫彼?Arg,R),家系中2例正常人和家系以外100例正常人未發(fā)現此突變。(2)探索了掌跖角化癥從皮膚鏡、RCM和組織病理學檢查臨床表現特點,皮膚鏡下可見增厚的角質層成黃色條紋狀分布并伴有紅色點狀血管擴張,RCM顯示角質層增厚,顆粒層、棘層細胞增殖,真皮淺層毛細血管擴張,組織病理學顯示角化不全,皮突延長,棘細胞間水腫,真皮淺層,淋巴組織細胞浸潤。研究結論:(1)DSP的雜合錯義突變c.3550CT是導致該家系臨床表型的主要原因;(2)掌跖角化在不同檢測手段下臨床表現各有特點,這些檢測可作為其臨床分型提供有力證據。第二節(jié)一個遺傳性反甲伴白甲家系基因突變分析研究研究背景:遺傳性白甲伴反甲是一種罕見的指甲營養(yǎng)發(fā)育不良,其特征在于指甲板的顏色變白。PLCD1基因的突變已被確定為遺傳性白甲(Hereditary leukonychia,HL)的主要致病基因。然而,在中國漢族人群中,相關的報道分析仍然十分少見。研究目的:本研究旨在探討中國漢族家系遺傳性白甲伴反甲家系病例的典型臨床特征及其與PLCD1基因突變的相關性。研究方法:本研究中,收集了一個遺傳性白甲伴反甲的家系,通過采集外周血,并且進行基因組DNA抽提,通過全外顯子測序(whole exome sequencing,WES)篩選PLCD1基因的致病突變位點和其他遺傳性白甲的候選基因,并進行不同物種PLCD1基因序列保守性進行比對。研究結果:該家系共有3代,其中3名患者、12名正常家系成員,共采集3例外周血標本,其中患者2例,正常家系成員1例做為對照�；颊叩呐R床表型主要為雙指(趾)甲板顏色變白,甲遠端有粉紅色條帶,甲中央凹陷邊緣翹起,可累及部分或全部甲。在先證者及先證者之母親外周血中,發(fā)現PLCD1基因9號外顯子中一個新的雜合子錯義突變,c.1451AG,這個突變沒有在家系其他健康人及100名無親緣關系對照組人群中檢測到,該家系其他成員未檢測出PLCD1基因突變。研究結論:本研究在一個中國漢族遺傳性白甲伴反甲家系中檢測出PLCD1基因一個雜合錯義突變,該錯義突變?yōu)橹虏⌒酝蛔兎嵌鄳B(tài)性位點變化,是國內外首次報道的新突變;我們的研究結果豐富了遺傳性白甲伴反甲的遺傳學突變譜,為將來實現單基因遺傳性皮膚疾病的精準診療打下基礎。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R751;R593.241
【圖文】：

逡逑主成分分析（ＰＣＡ）顯示，ＮＨＶ和ＳＬＥ的表達譜差異明顯，而輕度活動組逡逑和重度活動組的變異相對較小（圖１Ａ）。熱圖分析進一步說明了該分析結果（圖逡逑１Ｂ）。同時發(fā)現，與其他樣本相比，兩名ＳＬＥ患者（ｓｌｅｌ和ｓｌｅ９）顯示出不同的逡逑相關性。逡逑為了進一步闡明具體基因在ＳＬＥ疾病發(fā)展和進展過程中的變化，我們分析逡逑了特異性上調和下調的基因。差異表達分析顯示疾病組（ＳＬＥ）與正常（ＮＨＶ）逡逑組之間差異表達的基因共有２１４６個，其中１０４０個基因在ＳＬＥ患者中表達水平逡逑較高，１１０６個基因在健康個體中表達水平升高（圖２Ａ）。為了確定與疾病嚴重逡逑程度相關的基因表達模式，我們將ＳＬＥ輕度活動組、重度活動組與ＮＨＶ組進行逡逑兩兩比較：結果顯示ＳＬＥ輕度組與ＮＨＶ組相比，差異基因有１６６２個，ＳＬＥ組逡逑有７３９個上調基因，９２３個下調基因；而ＳＬＥ重度活動組與ＮＨＶ組相比，有差逡逑２８逡逑

沒有顯著的統(tǒng)計學差異性。因此，可以得出結論，在ＳＬＥ和ＮＨＶ之間觀察到顯逡逑著的差異表達，但是對于ＳＬＥ嚴重組和輕度組比較，表達差異沒有統(tǒng)計學意義逡逑（圖２Ｂ）。通過分析輕度重度ＳＬＥ組與對照組差異基因可以發(fā)現，ＳＬＥ組與對逡逑照組統(tǒng)計學差異較明顯基因，很多也是輕度ＳＬＥ組與重度ＳＬＥ組的重疊基因，逡逑數據說明，ＳＬＥ患者中，不同疾病活動度差異基因的表達模式是相似的（圖２Ｃ）。逡逑Ｄｉｓｅａｓｅ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ邐Ｍ？Ｗ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑Ｊ２２５逡逑８９邐１４１逡逑ｉ邋１２９３逡逑５３９邐３邋Ｂ逡逑５１５逡逑Ｓｅｖｅｒｅ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖２Ａ．邋ＳＬＥ輕度活動組、重度活動組與ＮＨＶ組差異表達基因比較逡逑ＳＬＥ輕度、重度組與ＮＨＶ組比較，差異基因共２１４６個，上調基因１０４０個，下逡逑調基因１１０６個；輕度ＳＬＥ與ＮＨＶ比較，差異基因共１６６２個，上調基因７３９個，逡逑下調基因９２３個；重度ＳＬＥ與ＮＨＶ比較，差異基因共２３５０個，上調基因１１３７逡逑個，下調基因１２１３個；重度ＳＬＥ與輕度ＳＬＥ：差異基因共５０個，其中３３個上逡逑調基因，１７個下調基因。逡逑２９逡逑

．邋＝？邋ｔ－Ｍｔｉ邋，逡逑圖２Ｃ．ＲＮＡ－Ｓｅｑ測序分析中，ＳＬＥ輕度活動組、重度活動組與ＮＨＶ組進行麗逡逑比較，各組統(tǒng)計學差異較明顯的差異基因逡逑ＳＬＥ疾病組與對照組４０個差異顯著基因列表（２０個上調基因，２０個下調基因）；逡逑輕度活動度ＳＬＥ組與重度活動度ＳＬＥ組４０個差異顯著基因列表（２０個上調基逡逑因，２０個下調基因）；重度活動度ＳＬＥ組與對照組４０個差異顯著基因列表（２０逡逑個上調基因，２０個下調基因）逡逑３０逡逑

【相似文獻】

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1 周沛華,蔣喬倉;點狀掌跖角化癥一例[J];中華皮膚科雜志;1995年03期

2 周飛紅;;合并內臟惡性腫瘤的掌跖角化癥[J];國外醫(yī)學.皮膚病學分冊;1988年04期

3 趙娟;;二例長島型掌跖角化癥及其基因分析[J];內蒙古醫(yī)學雜志;2019年07期

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本文編號：2767354