【摘要】：第一部分高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的分子異質(zhì)性和關(guān)鍵基因功能的初步探索研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一種自身免疫性疾病,表現(xiàn)為多個(gè)器官及系統(tǒng)受累,其中包括腎臟、皮膚、關(guān)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)等的炎癥反應(yīng),疾病的活動(dòng)度隨著病情波動(dòng)而不斷變化,同時(shí)出現(xiàn)抗核抗體等多種自身抗體。SLE的病因和誘導(dǎo)因素是多種多樣的,其中包括遺傳因素、環(huán)境因素、感染因素以及精神因素等多個(gè)方面,其中遺傳因素有著重要的作用。而在SLE的治療過程中,還沒有一個(gè)特異性治療方法,只能以緩解病情為目的進(jìn)行治療和控制,長(zhǎng)期的炎癥狀態(tài)和藥物副作用嚴(yán)重影響著患者生活質(zhì)量。因此針對(duì)SLE的發(fā)病機(jī)制,探索其遺傳學(xué)病因及功能顯得尤為重要。本課題組前期通過外顯子芯片研究、基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study,GWAS)在中國(guó)漢族人群已經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)多個(gè)新的SLE的易感基因及位點(diǎn),揭示了 SLE部分遺傳易感機(jī)制。而GWAS分析發(fā)現(xiàn)的只是基因變異與疾病風(fēng)險(xiǎn)之間一種統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù),由于基因組連鎖不平衡,所篩選出的易感功能性基因及致病機(jī)理大多不明。為了實(shí)現(xiàn)從統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)到疾病發(fā)病機(jī)理的跨越,揭示疾病機(jī)制,需要開展功能性基因轉(zhuǎn)錄組的篩選鑒定以及基因功能探索研究。研究目的:本研究旨在篩選SLE差異表達(dá)的易感基因,初步探索其在疾病中的功能及可能的作用機(jī)制。研究方法:1.在SLE患者及健康對(duì)照個(gè)體外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中開展高通量RNA-seq測(cè)序分析及差異性表達(dá)驗(yàn)證;2.利用磁珠分選人PBMC中的CD3+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞,Q-PCR檢測(cè)并篩選目的基因的表達(dá)差異;3.體外實(shí)驗(yàn)中,在THP1、U937單核細(xì)胞系、PMA誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞中,通過IFN-γ及LPS刺激炎癥反應(yīng),利用Q-PCR分別檢測(cè)TCN2基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。研究結(jié)果:1.RNA-seq測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,SLE患者PBMC細(xì)胞中共篩選出2146個(gè)差異基因,其中1040個(gè)基因表達(dá)上調(diào),1106個(gè)基因表達(dá)下調(diào),以p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;設(shè)計(jì)引物對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異基因較大的20個(gè)基因,在SLE和對(duì)照組中的表達(dá)水平進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證,結(jié)果證實(shí)差異基因表達(dá)與RNA-seq測(cè)序篩查預(yù)測(cè)結(jié)果一致。2.通過檢測(cè)SLE患者CD3+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞中差異基因表達(dá)水平,證實(shí)在SLE患者T細(xì)胞中IFI6基因表達(dá)顯著上調(diào),在單核細(xì)胞中RNASE1和TCN2表達(dá)異常。3.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)IFN-γ和LPS刺激炎癥反應(yīng)下,可以促進(jìn)TNC2在單核細(xì)胞系和誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。研究結(jié)論:在SLE患者PBMC的RNA-seq測(cè)序分析中,最終篩查出差異表達(dá)的基因2146個(gè),其中上調(diào)的有1040個(gè),表達(dá)下調(diào)的有1106個(gè)基因。對(duì)20個(gè)差異基因的Q-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序分析結(jié)果一致。在CD3+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞中,TCN2基因和RNASE1基因表達(dá)差異明顯,提示這兩個(gè)基因可能成為潛在的診斷、判斷疾病活動(dòng)度及預(yù)后的分子標(biāo)志物。TCN2可能成為調(diào)節(jié)炎癥通路關(guān)鍵基因,為SLE治療和基因組學(xué)的功能研究提供了新的潛在靶點(diǎn)。第二部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感基因HLA-DR3和HLA-DR15與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析研究目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為一種遺傳性自身免疫病,遺傳因素在其發(fā)病的過程中占有重要的位置,越來越多的研究表明HLA-DRB1的基因多態(tài)性與SLE有著密切的關(guān)聯(lián)性,本研究旨在運(yùn)用薈萃分析方法綜合評(píng)估HLA-DRB1基因的兩種基因型(HLA-DR3和HLA-DR15)與SLE發(fā)病易感性的相關(guān)性。研究方法:截至 2018 年 6 月,從 PubMed,Elsevier Science,Springer Link,Medline和Cochrane圖書館數(shù)據(jù)庫中搜索HLA-DRB1和SLE的研究,通過STATA14.0軟件建立隨機(jī)效應(yīng)模型,利用比值比(OR)與95%置信區(qū)間(CI)進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果:本研究共計(jì)納入23項(xiàng)研究,其中包括5261例SLE病例和9838例對(duì)照樣本�？傮w分析顯示HLA-DR3和HLA-DR15多態(tài)性與SLE疾病易感性存在有較強(qiáng)相關(guān)性(OR:1.60,95%CI:1.316-1.934,p=0.129 和 OR:1.68,95%CI:1.334-2.112,p=0.001)。亞組分析證明了 HLA-DR3 和 HLA-DR15 多態(tài)性的異質(zhì)性來源中,種族差異是重要原因之一。白種人與HLA-DR3關(guān)聯(lián)研究中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR:1.60,95%CI1.320-1.960,p=0.522),而東亞人群特異性參與了HLA-DR15 與 SLE發(fā)病異質(zhì)性的構(gòu)成(OR:1.65,95%CI:1.248-2.173,p=0.001)。此外,樣本人群來源是參與形成HLA-DR3和HLA-DR15多態(tài)性異質(zhì)性的另一個(gè)因素。在HLA-DR3的異質(zhì)性研究中,社區(qū)人群的樣本來源參與構(gòu)成異質(zhì)性(OR:1.65,95%CI:1.37-1.99,p0.01)。在HLA-DR15異質(zhì)性分析中,社區(qū)來源的樣本以及醫(yī)院來源的樣本都參與構(gòu)成異質(zhì)性來源(OR:1.378,95%CI:1.078-1.760,p0.01 和 OR:2.08,95%CI:1.738-2.49,p0.01)。研究結(jié)論:HLA-DRB1基因可能是SLE的易感基因,其兩個(gè)基因型HLA-DR3和HLA-DR15與SLE存在顯著相關(guān)性。第三部分兩種單基因遺傳性皮膚病家系的基因突變分析:一個(gè)掌跖角化癥家系基因突變分析研究;一個(gè)遺傳性反甲伴有白甲家系基因突變分析研究第一節(jié)一個(gè)掌跖角化癥家系基因突變分析研究研究背景:掌跖角化癥(palmoplantarkeratoderma,PPK)為一種單基因病,遺傳方式以常染色體顯性遺傳為主,主要表現(xiàn)為掌跖部位皮膚角化過度,角質(zhì)層增厚,表皮各層增生,根據(jù)其臨床表型的不同可以分為多種亞型,根據(jù)皮損形態(tài)可分為點(diǎn)狀掌跖角化癥、條紋狀掌跖角化癥、局灶型掌跖角化癥,彌漫性掌跖角化癥,根據(jù)發(fā)病特點(diǎn)可以分為單發(fā)型或合并其他系統(tǒng)疾病以綜合征形式發(fā)病,其中綜合征,不乏包含有致死性疾病如遺傳性大皰性表皮松解癥,心肌病等,因此僅僅靠臨床表現(xiàn)來精準(zhǔn)的判斷掌跖角化癥的亞型是十分困難的。有文獻(xiàn)報(bào)道,DSP基因致病突變可以使部分掌跖角化癥患者伴有羊毛狀卷發(fā),擴(kuò)張型心肌病、遺傳性大皰性表皮松解癥、廣泛淺表性膿皰病等多種并發(fā)癥狀。DSP基因,編碼Desmoplakin蛋白質(zhì),參與形成細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架接頭,功能失調(diào)可以導(dǎo)致皮膚增殖紊亂,因此,通過基因檢測(cè)技術(shù)結(jié)合其他輔助檢查技術(shù),對(duì)疾病亞型進(jìn)行精準(zhǔn)的判斷,發(fā)現(xiàn)并探索致病基因及突變的類型及功能,對(duì)于遺傳性皮膚病的精準(zhǔn)診療起到了十分重要的作用。研究目的:收集一個(gè)中國(guó)漢族條紋狀掌跖角化癥家系,對(duì)該家系的致病基因、突變及臨床表型進(jìn)行分析,結(jié)合皮膚鏡、皮膚反射式共聚焦(RCM)檢查、組織病理學(xué)等多維手段探索掌跖角化癥臨床表型,以更加精準(zhǔn)探討掌跖角化癥致病基因、突變與臨床表型的關(guān)系,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)探索。研究方法:(1)采集一個(gè)掌跖角化癥家系4名成員的外周血,使用Sanger測(cè)序的方法對(duì)該家系中2名患者進(jìn)行基因突變檢測(cè),以家系中2名健康家系成員和100名無親緣關(guān)系的正常人作為對(duì)照(2)通過皮膚鏡、RCM以及組織病理學(xué)等多種輔助診斷方案進(jìn)行檢查,建立和豐富掌跖角化癥多維皮膚影像資源庫。研究結(jié)果:(1)該家系中,DSP基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的雜合錯(cuò)義突變c.3550 CT,從而導(dǎo)致色氨酸(Trp,W)突變?yōu)榫彼?Arg,R),家系中2例正常人和家系以外100例正常人未發(fā)現(xiàn)此突變。(2)探索了掌跖角化癥從皮膚鏡、RCM和組織病理學(xué)檢查臨床表現(xiàn)特點(diǎn),皮膚鏡下可見增厚的角質(zhì)層成黃色條紋狀分布并伴有紅色點(diǎn)狀血管擴(kuò)張,RCM顯示角質(zhì)層增厚,顆粒層、棘層細(xì)胞增殖,真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張,組織病理學(xué)顯示角化不全,皮突延長(zhǎng),棘細(xì)胞間水腫,真皮淺層,淋巴組織細(xì)胞浸潤(rùn)。研究結(jié)論:(1)DSP的雜合錯(cuò)義突變c.3550CT是導(dǎo)致該家系臨床表型的主要原因;(2)掌跖角化在不同檢測(cè)手段下臨床表現(xiàn)各有特點(diǎn),這些檢測(cè)可作為其臨床分型提供有力證據(jù)。第二節(jié)一個(gè)遺傳性反甲伴白甲家系基因突變分析研究研究背景:遺傳性白甲伴反甲是一種罕見的指甲營(yíng)養(yǎng)發(fā)育不良,其特征在于指甲板的顏色變白。PLCD1基因的突變已被確定為遺傳性白甲(Hereditary leukonychia,HL)的主要致病基因。然而,在中國(guó)漢族人群中,相關(guān)的報(bào)道分析仍然十分少見。研究目的:本研究旨在探討中國(guó)漢族家系遺傳性白甲伴反甲家系病例的典型臨床特征及其與PLCD1基因突變的相關(guān)性。研究方法:本研究中,收集了一個(gè)遺傳性白甲伴反甲的家系,通過采集外周血,并且進(jìn)行基因組DNA抽提,通過全外顯子測(cè)序(whole exome sequencing,WES)篩選PLCD1基因的致病突變位點(diǎn)和其他遺傳性白甲的候選基因,并進(jìn)行不同物種PLCD1基因序列保守性進(jìn)行比對(duì)。研究結(jié)果:該家系共有3代,其中3名患者、12名正常家系成員,共采集3例外周血標(biāo)本,其中患者2例,正常家系成員1例做為對(duì)照�；颊叩呐R床表型主要為雙指(趾)甲板顏色變白,甲遠(yuǎn)端有粉紅色條帶,甲中央凹陷邊緣翹起,可累及部分或全部甲。在先證者及先證者之母親外周血中,發(fā)現(xiàn)PLCD1基因9號(hào)外顯子中一個(gè)新的雜合子錯(cuò)義突變,c.1451AG,這個(gè)突變沒有在家系其他健康人及100名無親緣關(guān)系對(duì)照組人群中檢測(cè)到,該家系其他成員未檢測(cè)出PLCD1基因突變。研究結(jié)論:本研究在一個(gè)中國(guó)漢族遺傳性白甲伴反甲家系中檢測(cè)出PLCD1基因一個(gè)雜合錯(cuò)義突變,該錯(cuò)義突變?yōu)橹虏⌒酝蛔兎嵌鄳B(tài)性位點(diǎn)變化,是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道的新突變;我們的研究結(jié)果豐富了遺傳性白甲伴反甲的遺傳學(xué)突變譜,為將來實(shí)現(xiàn)單基因遺傳性皮膚疾病的精準(zhǔn)診療打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R751;R593.241
【圖文】：

逡逑主成分分析（ＰＣＡ）顯示，ＮＨＶ和ＳＬＥ的表達(dá)譜差異明顯，而輕度活動(dòng)組逡逑和重度活動(dòng)組的變異相對(duì)較�。▓D１Ａ）。熱圖分析進(jìn)一步說明了該分析結(jié)果（圖逡逑１Ｂ）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與其他樣本相比，兩名ＳＬＥ患者（ｓｌｅｌ和ｓｌｅ９）顯示出不同的逡逑相關(guān)性。逡逑為了進(jìn)一步闡明具體基因在ＳＬＥ疾病發(fā)展和進(jìn)展過程中的變化，我們分析逡逑了特異性上調(diào)和下調(diào)的基因。差異表達(dá)分析顯示疾病組（ＳＬＥ）與正常（ＮＨＶ）逡逑組之間差異表達(dá)的基因共有２１４６個(gè)，其中１０４０個(gè)基因在ＳＬＥ患者中表達(dá)水平逡逑較高，１１０６個(gè)基因在健康個(gè)體中表達(dá)水平升高（圖２Ａ）。為了確定與疾病嚴(yán)重逡逑程度相關(guān)的基因表達(dá)模式，我們將ＳＬＥ輕度活動(dòng)組、重度活動(dòng)組與ＮＨＶ組進(jìn)行逡逑兩兩比較：結(jié)果顯示ＳＬＥ輕度組與ＮＨＶ組相比，差異基因有１６６２個(gè)，ＳＬＥ組逡逑有７３９個(gè)上調(diào)基因，９２３個(gè)下調(diào)基因；而ＳＬＥ重度活動(dòng)組與ＮＨＶ組相比，有差逡逑２８逡逑

沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。因此，可以得出結(jié)論，在ＳＬＥ和ＮＨＶ之間觀察到顯逡逑著的差異表達(dá)，但是對(duì)于ＳＬＥ嚴(yán)重組和輕度組比較，表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義逡逑（圖２Ｂ）。通過分析輕度重度ＳＬＥ組與對(duì)照組差異基因可以發(fā)現(xiàn)，ＳＬＥ組與對(duì)逡逑照組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異較明顯基因，很多也是輕度ＳＬＥ組與重度ＳＬＥ組的重疊基因，逡逑數(shù)據(jù)說明，ＳＬＥ患者中，不同疾病活動(dòng)度差異基因的表達(dá)模式是相似的（圖２Ｃ）。逡逑Ｄｉｓｅａｓｅ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ邐Ｍ？Ｗ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑Ｊ２２５逡逑８９邐１４１逡逑ｉ邋１２９３逡逑５３９邐３邋Ｂ逡逑５１５逡逑Ｓｅｖｅｒｅ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖２Ａ．邋ＳＬＥ輕度活動(dòng)組、重度活動(dòng)組與ＮＨＶ組差異表達(dá)基因比較逡逑ＳＬＥ輕度、重度組與ＮＨＶ組比較，差異基因共２１４６個(gè)，上調(diào)基因１０４０個(gè)，下逡逑調(diào)基因１１０６個(gè)；輕度ＳＬＥ與ＮＨＶ比較，差異基因共１６６２個(gè)，上調(diào)基因７３９個(gè)，逡逑下調(diào)基因９２３個(gè)；重度ＳＬＥ與ＮＨＶ比較，差異基因共２３５０個(gè)，上調(diào)基因１１３７逡逑個(gè)，下調(diào)基因１２１３個(gè)；重度ＳＬＥ與輕度ＳＬＥ：差異基因共５０個(gè)，其中３３個(gè)上逡逑調(diào)基因，１７個(gè)下調(diào)基因。逡逑２９逡逑

．邋＝？邋ｔ－Ｍｔｉ邋，逡逑圖２Ｃ．ＲＮＡ－Ｓｅｑ測(cè)序分析中，ＳＬＥ輕度活動(dòng)組、重度活動(dòng)組與ＮＨＶ組進(jìn)行麗逡逑比較，各組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異較明顯的差異基因逡逑ＳＬＥ疾病組與對(duì)照組４０個(gè)差異顯著基因列表（２０個(gè)上調(diào)基因，２０個(gè)下調(diào)基因）；逡逑輕度活動(dòng)度ＳＬＥ組與重度活動(dòng)度ＳＬＥ組４０個(gè)差異顯著基因列表（２０個(gè)上調(diào)基逡逑因，２０個(gè)下調(diào)基因）；重度活動(dòng)度ＳＬＥ組與對(duì)照組４０個(gè)差異顯著基因列表（２０逡逑個(gè)上調(diào)基因，２０個(gè)下調(diào)基因）逡逑３０逡逑

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1 周沛華,蔣喬倉;點(diǎn)狀掌跖角化癥一例[J];中華皮膚科雜志;1995年03期

2 周飛紅;;合并內(nèi)臟惡性腫瘤的掌跖角化癥[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚病學(xué)分冊(cè);1988年04期

3 趙娟;;二例長(zhǎng)島型掌跖角化癥及其基因分析[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志;2019年07期

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本文編號(hào)：2767354