【摘要】：研究背景流行病學(xué)研究顯示,糖尿病餐后高血糖的發(fā)生率高達(dá)50%,糖尿病前期約70%為單純性葡萄糖耐量。研究發(fā)現(xiàn)餐后高血糖與多種糖尿病慢性并發(fā)癥密切相關(guān),而控制餐后血糖升高是防治糖尿病的重要策略之一。近年來,作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要器官的小腸在餐后高血糖發(fā)生和糖尿病發(fā)病過程中的作用逐漸受到重視。研究認(rèn)為糖尿病小腸葡萄糖吸收功能病理性增強,與餐后血糖升高密切相關(guān)。小腸葡萄糖吸收主要由SGLT-1(鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運體1)和GLUT-2(葡萄糖轉(zhuǎn)運體2)介導(dǎo),其中,GLUT-2介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運是餐后小腸吸收葡萄糖的主要方式。進(jìn)食后,GLUT-2由小腸黏膜上皮細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)位至刷狀緣,以異化擴散形式將葡萄糖由腸腔轉(zhuǎn)運到血液中。而當(dāng)罹患糖尿病時,GLUT-2在小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣持續(xù)性定位,這可能是糖尿病小腸葡萄糖吸收功能增強及餐后高血糖的原因。因此,糾正糖尿病小腸葡萄糖吸收功能病理性增強成為治療糖尿病餐后高血糖的重要策略。小檗堿是中藥黃連的有效成分,是異喹啉類生物堿。因在治療腹瀉患者時偶然發(fā)現(xiàn)低血糖反應(yīng)而引起糖尿病相關(guān)研究者的關(guān)注。小檗堿治療糖尿病的作用機制包括改善糖尿病心血管功能、改善糖脂代謝、改善糖尿病和降低心血管疾病的危險因素等諸多方面。但因小檗堿的生物利用度低,其多項藥理學(xué)作用機制及臨床應(yīng)用存在爭議。盡管有研究表明小檗堿在腸道濃度高,可在腸道局部發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用,包括抑制二糖酶的功能;促進(jìn)GLP-1(胰高血糖素樣肽1)釋放;調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等。但小檗堿能否緩解糖尿病小腸葡萄糖吸收能力增強和餐后高血糖的直接證據(jù)依然缺乏。針對上述問題,我們課題組在以往研究的基礎(chǔ)上,對小檗堿降低糖尿病餐后高血糖的腸道機制做了深入研究。實驗?zāi)康奶接懶￠迚A改善糖尿病血糖是否與其在小腸局部影響葡萄糖轉(zhuǎn)運有關(guān),并探討其作用機制。實驗方法采用鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型。利用隨機數(shù)表法分組,小檗堿灌胃(200 mg/kg,BW,每日)6周過程中,檢測體重、空腹血糖變化情況。通過OGTT、IPGTT(口服葡萄糖耐量、腹腔注射葡萄糖耐量實驗)實驗檢測葡萄糖耐量變化,采用ELISA方法檢測血清中GLP-1、GLP-2和胰島素水平,并檢測血清和小腸組織局部IGF-1(胰島素樣生長因子1)、IGFBP-3(胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3)水平。離體條件下,采用小腸組織和大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞系(IEC-6細(xì)胞)進(jìn)行熒光葡萄糖轉(zhuǎn)運和葡萄糖攝取實驗,觀察小檗堿對葡萄糖轉(zhuǎn)運和攝取的影響。提取組織、細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞膜蛋白,通過蛋白免疫印跡技術(shù)分析小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)位情況。進(jìn)一步,利用免疫熒光、免疫電鏡等技術(shù)觀察小檗堿對GLUT-2蛋白轉(zhuǎn)位的影響。進(jìn)而,綜合利用藥物抑制劑和si RNA技術(shù)探討小檗堿對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白作用進(jìn)行分子機制的研究。兩組間比較采用Dunnett-t檢驗,多個處理組兩兩之間比較采用SNK-q檢驗。實驗結(jié)果1.與正常對照組相比,STZ聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病組小鼠體重顯著性增加,空腹血糖水平升高,糖耐量異常。經(jīng)小檗堿(200 mg/kg/d,BW)灌胃6周治療后,相較于糖尿病組,糖尿病+小檗堿灌胃組小鼠體重降低、空腹血糖水平下降、葡萄糖耐量得到改善、HOMA-IR降低。2.糖尿病組小鼠小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運能力較正常組小鼠增高,糖尿病組小鼠單位進(jìn)食量所產(chǎn)生的糞便中葡萄糖含量降低。小檗堿(200 mg/kg/d,BW)灌胃6周后,與糖尿病組相比,糖尿病+小檗堿灌胃組小鼠小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運能力降低,糖尿病+小檗堿灌胃組小鼠單位進(jìn)食量所產(chǎn)生的糞便中葡萄糖含量升高。采用正常動物給予單次灌胃小檗堿(200 mg/kg,BW),觀察到單次灌胃小檗堿僅對OGTT實驗后的血糖變化具有抑制作用,而對IPGTT實驗后血糖變化無降低作用,檢測OGTT實驗后各時間點的血清胰島素水平,發(fā)現(xiàn)小檗堿單次灌胃組血清胰島素水平顯著性降低,提示小檗堿通過其在小腸局部的直接作用抑制小腸葡萄糖吸收,降低餐后血糖水平。3.離體條件下,利用小腸組織和IEC-6細(xì)胞研究小檗堿降低小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運。與正常組相比,小檗堿組小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運和細(xì)胞葡萄糖攝取呈現(xiàn)濃度依賴性降低,GLUT-2抑制劑phloretin(0.5 m M)和si RNA敲低GLUT-2表達(dá)均能阻斷小檗堿降低小腸組織葡萄糖轉(zhuǎn)運和細(xì)胞葡萄糖攝取。結(jié)果提示,小檗堿降低小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運是通過抑制GLUT-2來實現(xiàn)的。4.在糖尿病模型小鼠中,相較于正常對照組,糖尿病小鼠小腸GLUT-2表達(dá)增加,采用提取細(xì)胞膜進(jìn)行蛋白免疫印跡分析、免疫熒光實驗和免疫電鏡實驗等方法均觀察到:糖尿病小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞GLUT-2向刷狀緣轉(zhuǎn)位增多。小檗堿(200mg/kg/d,BW)灌胃6周后,相較于糖尿病組,糖尿病+小檗堿灌胃組小鼠小腸GLUT-2表達(dá)降低。同時,GLUT-2向刷狀緣轉(zhuǎn)位降低。高濃度葡萄糖(50 m M)處理IEC-6細(xì)胞模擬腸腔餐后高濃度葡萄糖的條件下,小檗堿處理可濃度依賴性降低IEC-6細(xì)胞GLUT-2轉(zhuǎn)位。以上結(jié)果提示,小檗堿降低小腸黏膜上皮細(xì)胞GLUT-2轉(zhuǎn)位至刷狀緣。5.與糖尿病組相比,小檗堿灌胃6周組小鼠小腸局部IGF-1、IGFBP-3水平降低,同時,小腸組織中IGF-1R和PLC-β2表達(dá)分別降低21.5%,23.1%,提示小檗堿灌胃6周可糾正糖尿病小鼠小腸局部IGF水平異常。6.小檗堿下調(diào)IEC-6細(xì)胞IGF-1R磷酸化,IGF-1R抑制劑AG1024和si RNA敲低IGF-1R表達(dá)均可阻斷小檗堿降低細(xì)胞葡萄糖攝取和GLUT-2轉(zhuǎn)位。同時,小檗堿下調(diào)IEC-6細(xì)胞PLC-β2胞膜定位,進(jìn)一步使用PLC-β2抑制劑U73122可阻斷小檗堿降低細(xì)胞葡萄糖攝取和GLUT-2轉(zhuǎn)位。使用IGF-1R抑制劑AG1024和si RNA敲低IGF-1R表達(dá)均可阻斷小檗堿降低細(xì)胞PLC-β2胞膜定位。提示小檗堿通過抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信號通路降低IEC-6細(xì)胞GLUT-2轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取。7.小檗堿上調(diào)IEC-6細(xì)胞AMPK磷酸化,AMPK抑制劑Compound C(10μM)可阻斷小檗堿降低細(xì)胞葡萄糖攝取和GLUT-2轉(zhuǎn)位。同時,AMPK抑制劑Compound C可阻斷小檗堿降低細(xì)胞IGF-1R磷酸化。提示小檗堿通過激活A(yù)MPK抑制IGF-1R,最終降低IEC-6細(xì)胞GLUT-2轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取。8.小檗堿未上調(diào)IEC-6細(xì)胞Akt磷酸化水平,PI3K抑制劑Wortmannin(10μM)未阻斷小檗堿降低細(xì)胞葡萄糖攝取和GLUT-2、PLC-β2胞膜定位,提示小檗堿降低IEC-6細(xì)胞GLUT-2轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取可能與PI3K-Akt信號通路無關(guān)。結(jié)論1.小檗堿降低小腸黏膜上皮細(xì)胞GLUT-2向刷狀緣轉(zhuǎn)位,從而抑制小腸葡萄糖的吸收,最終降低糖尿病小鼠餐后血糖水平2.小檗堿通過激活A(yù)MPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信號通路,進(jìn)而降低小腸黏膜上皮細(xì)胞GLUT-2刷狀緣轉(zhuǎn)位
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1
【圖文】：

介導(dǎo)的葡萄糖吸收無明顯作用。腸道內(nèi)分泌細(xì)胞同時表達(dá)瘦素受體和甜味受體，隨著血清瘦素濃度增高，腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的甜味受體對甜味劑的反應(yīng)性降低，但這一現(xiàn)象與小腸 GLUT-2 轉(zhuǎn)位作用的關(guān)系缺乏直接證據(jù)[35]。(4)應(yīng)激和糖皮質(zhì)激素：多種形式的應(yīng)激會引起糖皮質(zhì)激素釋放增多，進(jìn)而引起不同程度的胃腸功能障礙。由環(huán)境改變引起的應(yīng)激狀態(tài)會抑制 GLUT-2 介導(dǎo)的葡萄糖吸收，但 SGLT-1 介導(dǎo)的葡萄糖吸收不受影響，這種效應(yīng)可以通過給予動物地塞米松誘導(dǎo)。在禁水應(yīng)激情況下，SGLT-1 的活性被抑制，這是由于上皮細(xì)胞的鈉鉀-ATP 酶的活性受到抑制，而此時刷狀緣 GLUT-2 的定位呈現(xiàn)倍數(shù)升高。在禁食應(yīng)激時，腸腔內(nèi)糖的吸收主要依靠 SGLT-1完成；復(fù)食后，GLUT-2 會迅速向刷狀緣轉(zhuǎn)位。由此可見，不同應(yīng)激環(huán)境因素會通過不同機制影響 GLUT-2 的轉(zhuǎn)位，最終影響小腸葡萄糖的吸收[4]�？哲娷娽t(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文

圖 1. 小檗堿灌胃 6 周降低糖尿病小鼠體重，降低空腹血糖并改善葡萄糖耐量和全身胰島素敏感性A-B 圖：小檗堿灌胃 6 周過程中，各組小鼠體重變化和空腹血糖的變化。C-D 圖：小檗堿灌胃 6 周對各組小鼠葡萄糖耐量的影響。E-F 圖：小檗堿灌胃 6 周對各組小鼠血清胰島素水平、HOMA-IR 的影響。G 圖：小檗堿灌胃 6 周對各組小鼠血清 GLP-1 的影響。Control，對照組；Control+BBR，正常灌胃小檗堿（200 mg/Kg，BW）組；DM，糖尿病組；DM+BBR，糖尿病灌胃小檗堿（200 mg/Kg，BW）組；OGTT，口服葡萄糖耐量測定；IPGTT，腹腔注射葡萄糖耐量測定。正常小檗堿灌胃組與正常組相比：*P < 0.05，**P < 0.01，正常組與糖尿病組相比：# P <0.05，## P < 0.01，糖尿病小檗堿灌胃組與糖尿病組相比： P < 0.05， P < 0.01，n=6/組。

細(xì)胞葡萄糖攝取。以上實驗結(jié)果提示，小檗堿降低小腸葡萄糖吸收是通過抑制小腸黏膜上皮細(xì)胞 GLUT-2 來實現(xiàn)的。圖3 小檗堿劑量依賴性降低小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運和IEC-6細(xì)胞葡萄糖攝取，抑制GLUT-2可阻斷小檗堿降低葡萄糖轉(zhuǎn)運A 圖 濃度梯度小檗堿處理對小腸熒光葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響。B 圖 兩種葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對小檗堿降低小腸熒光葡萄糖吸收的影響。C 圖 濃度梯度小檗堿處理對 IEC-6 細(xì)胞熒光葡萄糖攝取的影響。D 圖兩種葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對小檗堿降低 IEC-6 細(xì)胞熒光葡萄糖攝取的影響。E 圖 siRNA 敲低 GLUT-2 表達(dá)。F 圖 siRNA 敲低 GLUT-2 表達(dá)后，小檗堿對 IEC-6 細(xì)胞熒光葡萄糖攝取影響的變化情況。HG：高糖（葡萄糖 50 mM）組，Phloridzin：根皮苷（SGLT-1 抑制劑，0.5 mM）組，Phloridzin+BBR 組：根皮苷+小檗堿（50 μM）組，Phloretin：根皮素（GLUT-2空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳照麗;IGF系統(tǒng)的生物學(xué)功能及其與腫瘤的關(guān)系[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);2003年01期

本文編號：2761770