【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種典型的自身免疫性疾病,患者臨床表現(xiàn)主要為體內(nèi)大量自身抗體的產(chǎn)生及其與自身抗原形成自身免疫復(fù)合物沉積所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和多器官損傷。SLE發(fā)病受到多種因素的影響,已有的研究指出遺傳因素在SLE的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用,同卵雙生患者一致率(24-69%)遠遠高于異卵雙生以及同胞間的患病率(2-5%)。SLE發(fā)病機制十分復(fù)雜,目前的研究并沒有系統(tǒng)性地闡明SLE的發(fā)病過程。當前的研究主要從引起SLE發(fā)生的幾個方面分別介紹其機制,如T細胞、B細胞及細胞因子的影響等。B細胞的過度活化是SLE患者體內(nèi)最主要的免疫學(xué)異常,以自身抗體的產(chǎn)生、異常抗原提呈、產(chǎn)生包括IL-10、IL-6等多種細胞因子與提供異常的B細胞信號為主要表現(xiàn)。許多基因在B細胞的分化發(fā)育過程中發(fā)揮作用,從而影響SLE的發(fā)生。盡管SLE的具體發(fā)病機制并不清楚,但大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study,GWAS)已經(jīng)充分證實了遺傳因素與SLE的相關(guān)性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)80多個基因與SLE的發(fā)病相關(guān),其中就包括我們所研究的WDFY4基因。WDFY4(WDFY family member 4)基因位于 10q11.23,是WDFY家族的第4位成員。WDFY4基因組序列含有近30萬個堿基,可以編碼一個含有3184個氨基酸的巨大蛋白。目前已經(jīng)有多個GWAS指出WDFY4與多個人群的SLE疾病易感相關(guān),且本課題組已明確了WDFY4導(dǎo)致SLE易感的具體位點。但是WDFY4基因?qū)е耂LE易感的具體機制尚未有報道不明確。有研究指出WDFY4在免疫系統(tǒng)中高表達,但目前還未見關(guān)于該基因功能的研究報道。第一部分Wdfy4條件性敲除小鼠的構(gòu)建及表型分析目前已知WDFY4與SLE疾病易感相關(guān),且我們前期的研究發(fā)現(xiàn)WDFY4在B淋巴細胞中高表達,為了明確WDFY4導(dǎo)致SLE易感的具體機制,我們利用Loxp-Cre系統(tǒng)首次構(gòu)建了B淋巴細胞條件性敲除Wdfy4的小鼠模型。我們在Wdfy4第三外顯子兩側(cè)插入Loxp序列,通過基因工程獲得Wdfy4flox/+小鼠,并將其與Cd19-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,在僅表達于B細胞的Cd19重組酶的作用下,Wdfy4第三外顯子發(fā)生重組,Wdfy4基因轉(zhuǎn)錄時發(fā)生移碼突變,翻譯提前終止,Wdfy4蛋白功能喪失。最終雜交所得的Wdfy4flox/flox;Cd19-Cre+/-小鼠即為Wdfy4 CKO小鼠,所有小鼠的出生符合孟德爾遺傳分離率。我們首先對Wdfy4 CKO及對照小鼠的基本表型進行分析,發(fā)現(xiàn)B細胞中敲除Wdfy4后,小鼠外周免疫器官脾臟中CD19陽性細胞數(shù)明顯少于對照小鼠,說明Wdfy4能夠影響B(tài)細胞的生存。我們對CKO小鼠及對照小鼠脾臟中各亞型B細胞分別分析,發(fā)現(xiàn)CKO小鼠中過渡1型(T1)、成熟B細胞、濾泡B細胞明顯減少,而過渡2型(T2)及邊緣B細胞沒有差異;因此我們認為Wdfy4在B淋巴細胞成熟過程中起重要作用。為了明確Wdfy4對B細胞早期發(fā)育的影響,我們對CKO小鼠及對照小鼠中樞免疫器官骨髓中B細胞各發(fā)育階段分別進行了檢測。我們發(fā)現(xiàn),與對照相比,CKO小鼠骨髓中總B細胞的數(shù)量并沒有發(fā)生改變,各發(fā)育階段中也只在Pre-B細胞階段出現(xiàn)了減少,因此我們認為Wdfy4對B細胞的早期發(fā)育過程沒有影響,而只是在B細胞由Pro到Pre的過渡過程中發(fā)揮部分作用。在明確了Wdfy4對B淋巴細胞數(shù)量的影響后,我們對B細胞功能進行了研究。由于B淋巴細胞的主要功能是分泌抗體,我們采用向小鼠腹腔注射人工抗原的方式對其進行人工免疫,然后利用ELISA實驗檢測免疫后小鼠血清中抗體分泌情況。在未進行人工免疫時,Wdfy4 CKO小鼠與對照小鼠血清中基礎(chǔ)水平的免疫球蛋白IgG和IgM沒有差異。接下來我們分別利用胸腺非依賴性(TI)抗原與胸腺依賴性(TD)抗原對兩種小鼠進行免疫,收集免疫后各時間點血清進行ELISA檢測。結(jié)果顯示,在進行TI抗原NP-Ficol1免疫后,Wdfy4 CKO小鼠與對照小鼠相比,血清中IgG及IgM抗體分泌量沒有差異。TD抗原NP-CGG免疫后,Wdfy4 CKO小鼠血清中IgM抗體分泌無差異,然而無論是總的NP20-29特異性IgG1抗體還是高親和力的NP1-4特異性IgG1抗體都發(fā)生了明顯減少,尤其高親和力IgG1抗體的比例出現(xiàn)了明顯降低。與此相一致的是,經(jīng)過免疫后,CKO小鼠骨髓及脾臟中B細胞的數(shù)量明顯減少,同時漿細胞數(shù)量和生發(fā)中心B細胞也發(fā)生減少。因此,我們認為敲除Wdfy4后,B細胞中抗體親和力成熟受到影響。綜合上述結(jié)果,我們得出結(jié)論,B淋巴細胞中敲除Wdfy4后,小鼠B細胞數(shù)量減少,且功能受到抑制。第二部分利用狼瘡模型研究Wdfy4在SLE發(fā)病中的作用B細胞的過度活化是SLE患者體內(nèi)最主要的免疫學(xué)異常,許多基因在B細胞的分化發(fā)育過程中發(fā)揮作用,從而影響SLE的發(fā)生。從第一部分的研究中我們得出Wdfy4參與了B細胞的發(fā)育及分化功能,那么Wdfy4對B細胞的這種作用是否影響了 SLE的發(fā)生呢?為了明確Wdfy4在SLE發(fā)病中的作用,我們利用化學(xué)誘導(dǎo)的方法構(gòu)建狼瘡模型,即分別向Wdfy4 CKO小鼠及對照小鼠注射0.5mL降植烷(Pristane),6個月后對小鼠SLE表型進行檢測。注射Pristane6個月后,我們對兩種基因型小鼠SLE表型進行分析,處死小鼠,觀察并記錄小鼠的各項生理指標。脾臟重量及脾重/體重比是衡量小鼠狼瘡表型嚴重程度的重要指標,于是我們首先對兩組小鼠的脾重及脾重/體重比進行了檢測,結(jié)果顯示,對照組小鼠脾臟明顯腫脹,而Wdfy4 CKO小鼠脾腫大癥狀明顯緩解,脾重/體重比也低于對照。同時對兩組小鼠脾臟進行HE染色后發(fā)現(xiàn),對照組小鼠經(jīng)Pristane誘導(dǎo)后,脾臟紅髓與白髓分界不清,結(jié)構(gòu)紊亂,而Wdfy4 CKO小鼠脾臟未出現(xiàn)這種改變。因此,經(jīng)過狼瘡誘導(dǎo)后,Wdfy4 CKO小鼠脾臟表型輕于對照小鼠。此外,由于狼瘡小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的大量自身抗體及免疫復(fù)合物通常累積在腎臟,從而誘發(fā)狼瘡樣腎炎,于是我們又對兩組小鼠腎臟的損傷程度進行了檢測。我們收集小鼠24 h尿液,采用考馬斯亮藍法檢測兩組小鼠蛋白尿含量,結(jié)果顯示W(wǎng)dfy4 CKO小鼠尿蛋白水平顯著低于對照小鼠。病理組織學(xué)分析也顯示,對照小鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂,腎小球增大,腎小球毛細血管基底膜增厚,有明顯的炎性細胞浸潤,而Wdfy4 CKO小鼠腎小球較為正常。我們又通過免疫熒光實驗對腎臟免疫復(fù)合物的沉積狀況進行了檢測,結(jié)果證實Wdfy4 CKO小鼠的腎臟中IgG沉積明顯少于對照小鼠。因此,經(jīng)過狼瘡誘導(dǎo)后,Wdfy4 CKO小鼠狼瘡腎炎表型輕于對照小鼠。利用ELISA實驗對小鼠血清中的抗體進行檢測也顯示兩組小鼠總的IgM,IgG及抗DNA雙鏈抗體IgM未有差異,而Wdfy4CKO小鼠自身反應(yīng)性的抗雙鏈DNA抗體IgG的滴度明顯低于對照小鼠。綜合上述結(jié)果,敲除Wdfy4后小鼠的狼瘡病理表現(xiàn)明顯減輕,表明該基因在SLE的發(fā)生中起著保護作用。第三部分WDFY4參與SLE發(fā)生發(fā)展的機制研究通過前面的研究我們認為Wdfy4是通過影響B(tài)細胞的生存和功能來影響SLE的發(fā)生,那么Wdfy4影響B(tài)細胞的具體機制是什么呢?由于目前沒有關(guān)于WDFY4功能的研究,我們從WDFY4的結(jié)構(gòu)入手,發(fā)現(xiàn)WDFY4在結(jié)構(gòu)上與同家族的WDFY3極為相似,而WDFY3所編碼的ALFY本身是一個自噬相關(guān)蛋白。同時目前許多研究已經(jīng)證實了自噬過程在B細胞的分化發(fā)育及功能中起著十分重要的作用,并且已經(jīng)有研究提出自噬的關(guān)鍵性因子Atg5可能通過調(diào)控自噬活動而參與自身性免疫疾病的發(fā)生。因此我們作出假設(shè),Wdfy4有可能是通過調(diào)控B細胞的自噬活動來影響其生存和功能進而影響SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。為了驗證我們的假設(shè),我們利用病毒載體構(gòu)建了敲低WDFY4的人B淋巴細胞瘤Raji細胞系。發(fā)現(xiàn)敲低WDFY4后,Raji細胞中LC3Ⅱ發(fā)生明顯累積。由于自噬活動本身是一種動態(tài)活動,LC3Ⅱ的累積可能是其自噬水平增加而使其產(chǎn)生增多,同時也有可能是由于自噬水平受到抑制導(dǎo)致溶酶體消化減少而引起LC3Ⅱ累積。我們用溶酶體抑制劑氯奎CQ對細胞進行處理,發(fā)現(xiàn)LC3Ⅱ的這種累積是進一步增加的,因此我們認為,在敲低WDFY4后,B淋巴細胞的自噬水平是增加的。同時為了驗證這一結(jié)果我們又利用免疫熒光實驗對細胞中LC3焦點的累積情況進行了檢測,由于Raji細胞細胞核較大而細胞質(zhì)較小,我們又構(gòu)建了敲低WDFY4的HEK293細胞系以觀察其胞質(zhì)中LC3焦點數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn)敲低WDFY4后LC3焦點增加,在加入CQ后焦點進一步增多,由此我們得出敲低WDFY4能夠增強自噬活動。另外,值得注意的是,當敲低WDFY4后,經(jīng)典自噬底物p62并沒有減少,而近年來所報道的非經(jīng)典自噬相關(guān)的PI3KC3表達量增加,因此我們認為WDFY4所影響的是非經(jīng)典的自噬途徑。已有研究指出非經(jīng)典的自噬能夠抑制自身炎癥減輕狼瘡反應(yīng),這也與我們第二部分的研究結(jié)果相一致。接下來我們又對上述結(jié)果進行了體內(nèi)驗證,我們將B細胞條件性敲除Wdfy4小鼠脾臟中B細胞分選出來,Western blot同樣顯示敲除Wdfy4后,LC3Ⅱ及PI3KC3出現(xiàn)累積。同時免疫熒光觀察LC3焦點形成情況,同樣地,敲除Wdfy4后LC3聚集現(xiàn)象更為明顯。通過以上結(jié)果我們得出結(jié)論,WDFY4通過抑制非經(jīng)典自噬途徑影響了B細胞的功能。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R593.241
【圖文】：

圖１－１小鼠交配策略逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｍｏｕｓｅ邋ｍａｔｉｎｇ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑因型鑒定逡逑試劑配制逡逑ｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ邋（ｐＨ８．３）溶液的配制：逡逑．１邋ｇＴｒｉｓ溶于８００邋ｍｌ三蒸水，加濃鹽酸調(diào)節(jié)ｐＨ值至８．３，待溶液冷卻后，逡逑三蒸水定容至１Ｌ。過濾或高壓滅菌，４°Ｃ保存。逡逑酶Ｋ緩沖液的配制：逡逑成分邐質(zhì)量或體積逡逑ＫＣ１邐３＿７３ｇ逡逑

ＬｘｗＰ邐？邋ＦＲＴ邐｜ｍ邋Ｅｘｏｎ邐Ｐｒ0ｂ？逡逑圖１－２邋以基因敲除策略逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｗｄｆｙ４邋ｋｎｏｃｋｏｕｔ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１２邐３邋４邐５邋６邐７邐１邐２邐３邐４邋５邋６邐７逡逑＾邐：邐Ａ．邐Ｉ焌、ｒ’３邋！ｒ．二Ｃ邋二Ｃ．：Ｊ邋５３４ｂＰ逡逑ｒ＾：；＾邋＿ｖ邋＿．ｒ．ｔＬ＿邋？邋：ｍ邋４２４ｂＰ邋ｐｒ－ｔ邋．一。邐＇邐＂＇邋｜逡逑｜ｌ：＇；－邐＾Ｘ３＂邋－，＾Ｃ３３０６ｂ＾邐：邋ｊ逡逑圖１－３小鼠基因型鑒定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｗｄｆｙ４邋ｆｌｏｘｅｄ邋ｍｉｃｅ逡逑條件性敲除小鼠敲除效率檢測逡逑首先我們對所構(gòu)建的奶坊＾條件性敲除小鼠的敲除效率進行了檢測，我們分逡逑別取純合條件性敲除小鼠（奶坊；邋０／７９－Ｃｒｅ＋／－）和純合Ｌｏｘｐ小鼠逡逑（奶辦的脾臟及骨髓組織，由于沒有用于檢測小鼠Ｗｄｆｙ４的商業(yè)化抗體，逡逑因此我們利用ｑＰＣＲ檢測其ｍＲＮＡ水平的表達量，發(fā)現(xiàn)不管是骨髓還是脾臟中逡逑的表達量都明顯低于對照（圖１－４）。由于我們特異性地在Ｂ淋巴細胞中逡逑敲除的砂么而骨髓以及脾臟中除Ｂ淋巴細胞外

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑組織ｍＲＮＡ不能準確評估Ｂ淋巴細胞中肌熱＾的敲除效率。我們利用磁珠分選逡逑的方法將小鼠脾臟中的Ｂ淋巴細胞分選出來（圖１－５），提�。遥危梁髾z測效率，逡逑發(fā)現(xiàn)在脾臟的Ｂ淋巴細胞中，肌仿ＣＫＯ小鼠奶砂４的表達量明顯低于對照，逡逑而在非Ｂ細胞中沒有這種差異（圖１－６）。至此，我們確定所構(gòu)建的肌辦４Ｂ淋逡逑巴細胞條件性敲除小鼠具有良好的敲除效率。逡逑Ａ邐ＢＭ邐Ｂ邐ＳＰ逡逑

本文編號：2761257